7.Применение сканирующего зондового микроскопа для исследования биологических объектов

7. Применение сканирующего зондового микроскопа для исследования биологических объектов 1

7.1. Цели работы 2

7.2. Информация для преподавателя 3

7.4. Методические указания 31

7.5. Техника безопасности 32

7.6. Задание 32

7.7. Контрольные вопросы 32

7.8. Литература 32

Лабораторная работа была разработана Нижегородским Государственным Университетом им. Н.И. Лобачевского

7.1.Цели работы

Исследование морфологических параметров биологических структур является важной задачей для биологов, поскольку размеры и форма некоторых структур во многом определяют их физиологические свойства. Сопоставляя морфологические данные с функциональными характеристиками можно получить полноценную информацию об участии живых клеток в поддержании физиологического баланса организма человека или животного.

Раньше биологи и медики имели возможность изучать свои препараты только на оптическом и электронном микроскопах. Эти исследования давали некую картину морфологии клеток, зафиксированных, окрашенных и с тонкими металлическими покрытиями, полученными путем напыления. Исследовать морфологию живых объектов, ее изменения под воздействием различных факторов не представлялось возможным, но являлось весьма заманчивым.

Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) открыла новые возможности в исследовании клеток, бактерий, биологических молекул, ДНК в условиях максимально приближенных к нативным. СЗМ позволяет исследовать биологические объекты без специальных фиксаторов и красителей, на воздухе, или даже в жидкой среде.

В настоящее время СЗМ используется в большом многообразии дисциплин, как в фундаментальных научных исследованиях, так и в прикладных высокотехнологичных разработках. Многие научно-исследовательские институты страны оснащаются аппаратурой зондовой микроскопии. В связи с этим постоянно растет спрос на высококлассных специалистов. Для его удовлетворения фирмой НТ-МДТ (г. Зеленоград, Россия) разработана специализированная учебно-научная лаборатория сканирующей зондовой микроскопии NanoEducator .

СЗМ NanoEducator специально разработан для проведения студентами лабораторных работ. Этот прибор ориентирован на студенческую аудиторию: он полностью управляется с помощью компьютера, имеет простой и наглядный интерфейс, анимационную поддержку, предполагает поэтапное освоение методик, отсутствие сложных настроек и недорогие расходные материалы.

В данной лабораторной работе Вы узнаете о сканирующей зондовой микроскопии, познакомитесь с ее основами, изучите конструкцию и принципы работы учебного СЗМ NanoEducator , научитесь готовить биологические препараты для исследований, получите свое первое СЗМ изображение комплекса кисломолочных бактерий и научитесь основам обработки и представления результатов измерений.

7.2.Информация для преподавателя 1

Лабораторная работа выполняется в несколько этапов:

1. Подготовка образца выполняется каждым студентом индивидуально.

2. Получение первого изображения выполняется на одном приборе под контролем преподавателя, далее каждый студент исследует свой образец самостоятельно.

3. Обработка экспериментальных данных каждым студентом производится индивидуально.

Образец для исследования: кисломолочные бактерии на покровном стекле.

До начала работы необходимо подобрать зонд с наиболее характерной амплитудно-частотной характеристикой (одиночный симметричный максимум), получить изображение поверхности исследуемого образца.

Отчет по лабораторной работе должен включать:

1. теоретическую часть (ответы на контрольные вопросы).

2. результаты экспериментальной части (описание проведенных исследований, полученные результаты и сделанные выводы).

1. Методы исследований морфологии биологических объектов.

2. Сканирующий зондовый микроскоп:

конструкция СЗМ;

разновидности СЗМ: СТМ, АСМ;

формат СЗМ данных, визуализация СЗМ данных.

3. Подготовка образцов для СЗМ исследований:

морфология и структура бактериальных клеток;

приготовление препаратов для изучения морфологии с применением СЗМ.

4. Знакомство с конструкцией и программой управления СЗМ NаnoEducator.

5. Получение СЗМ изображения.

6. Обработка и анализ полученных изображений. Количественная характеризация СЗМ изображений.

Методы исследования морфологии биологических объектов

Характерный диаметр клеток составляет 10  20 мкм, бактерий от 0.5 до 35 мкм, эти величины в 5 раз мельче мельчайшей частицы, видимой невооруженным глазом. Поэтому первое изучение клеток стало возможным только после появления оптических микроскопов. В конце XVII в. Антонио ван Левенгук изготовил первый оптический микроскоп, до этого люди и не подозревали о существовании болезнетворных микробов и бактерий [Лит. 7 -1].

Оптическая микроскопия

Трудности изучения клеток связаны с тем, что они бесцветны и прозрачны, поэтому открытие их основных структур состоялось только после введения в практику красителей. Красители обеспечили достаточный контраст изображения. С помощью оптического микроскопа можно различать объекты, отстоящие друг от друга на 0.2 мкм, т.е. самыми маленькими объектами, которые еще можно различать в оптическом микроскопе являются бактерии и митохондрии. Изображения более мелких элементов клеток искажаются эффектами, вызванными волновой природой света.

Для приготовления долго сохраняющихся препаратов клетки обрабатывают фиксирующим агентом с тем, чтобы иммобилизовать и сохранить их. Кроме того, фиксация повышает доступность клеток красителям, т.к. макромолекулы клеток скрепляются поперечными сшивками, что стабилизирует и закрепляет их в определенном положении. Чаще всего в качестве фиксаторов выступают альдегиды и спирты (например, глутаральдегид или формальдегид формируют ковалентные связи со свободными аминогруппами белков и сшивают соседние молекулы). После фиксации ткани обычно нарезают микротомом на очень тонкие срезы (толщиной от 1 до 10 мкм), которые затем помещают на предметное стекло. При таком способе подготовки можно повредить структуру клеток или макромолекул, поэтому предпочтительным методом является быстрое замораживание. Замороженную ткань режут микротомом, установленным в холодной камере. После приготовления срезов клетки окрашивают. В основном для этой цели используют органические красители (малахитовую зелень, судан черный и т.д.). Каждый из них характеризуется определенным сродством к клеточным компонентам, например, гематоксилин обладает сродством к отрицательно заряженным молекулам, поэтому позволяет выявить в клетках ДНК. Если та или иная молекула представлена в клетке в незначительном количестве, то удобнее всего использовать флуоресцентную микроскопию.

Флуоресцентная микроскопия

Флуоресцирующие красители поглощают свет одной длины волны и излучают свет другой, большей длины волны. Если такое вещество облучить светом, длина волны которого совпадает с длиной волны света, поглощаемого красителем, и затем для анализа использовать фильтр, пропускающий свет с длиной волны, соответствующей свету, излучаемому красителем, флуоресцирующую молекулу можно выявить по свечению на темном поле. Высокая интенсивность излучаемого света является характерной особенностью таких молекул. Применение флуоресцирующих красителей для окраски клеток предполагает использование специального флуоресцентного микроскопа.Такой микроскоп похож на обычный оптический, но свет от мощного осветителя проходит через два набора фильтров - один для задержания части излучения осветителя перед образцом и другой для фильтрации света, полученного от образца. Первый фильтр выбран таким образом, что он пропускает лишь свет длины волны, возбуждающей определенный флуоресцирующий краситель; в то же время второй фильтр блокирует этот падающий свет и пропускает свет длины волны, излучаемой красителем при его флуоресценции.

Флуоресцентная микроскопия часто используется для выявления специфических белков или других молекул, которые становятся флуоресцирующими после ковалентного связывания с флуоресцирующими красителями. Для этой цели обычно используют два красителя - флуоресцеин, который дает интенсивную желто-зеленую флуоресценцию после возбуждения светло-голубым светом, и родамин, обусловливающий темно-красную флуоресценцию после возбуждения желто-зеленым светом. Применяя для окраски и флюоресцин и родамин можно получать распределение различных молекул.

Темнопольная микроскопия

Простейший способ разглядеть детали клеточной структуры – наблюдать свет, рассеивающийся различными компонентами клетки. В темнопольном микроскопелучи от осветителя направляются сбоку и при этом в объектив микроскопа попадают только рассеянные лучи. Соответственно, клетка выглядит как освещенный объект на темном поле. Одним из основных преимуществ темнопольной микроскопии является возможность наблюдать движение клеток в процессе деления и миграции. Клеточные движения, как правило, совершаются очень медленно и их сложно наблюдать в реальном времени. В этом случае используют покадровую (цейтраферную) микрокиносъемку или видеозапись. Последовательные кадры при этом разделены во времени, но при воспроизведении записи с нормальной скоростью картина реальных событий ускоряется.

В последние годы видеокамеры и соответствующие технологии обработки изображения значительно увеличили возможности оптической микроскопии. Благодаря их применению удалось преодолеть трудности, обусловленные особенностями физиологии человека. Они состоят в том, что:

1. Глаз в обычных условиях не регистрирует очень слабый свет.

2. Глаз не способен фиксировать небольшие отличия в интенсивности света на ярком фоне.

Первая из этих проблем была преодолена после присоединения к микроскопу сверхвысокочувствительных видеокамер. Это позволило наблюдать клетки в течение длительного времени при низкой освещенности, исключая длительное воздействие яркого света. Системы обработки изображения особенно важны для изучения в живых клетках флуоресцирующих молекул. Поскольку изображение создается видеокамерой в форме электронных сигналов, его можно соответствующим образом преобразовать в числовые сигналы, направить в компьютер и затем подвергнуть дополнительной обработке для извлечения скрытой информации.

Высокий контраст, достижимый с помощью компьютерной интерференционной микроскопии, позволяет наблюдать даже очень мелкие объекты, как, например, отдельные микротрубочки, диаметр которых менее одной десятой длины волны света (0.025 мкм). Отдельные микротрубочки можно увидеть и с помощью флуоресцентной микроскопии. Однако в обоих случаях неизбежны эффекты дифракции, сильно изменяющие изображение. Диаметр микротрубочек при этом завышается (0.2 мкм), что не позволяет отличать отдельные микротрубочки от пучка из нескольких микротрубочек. Для решения этой задачи необходим электронный микроскоп, предел разрешения которого сдвинут далеко за пределы длины волны видимого света.

Электронная микроскопия

Взаимосвязь длины волны и предела разрешения сохраняется и для электронов. Однако для электронного микроскопа предел разрешения существенно ниже дифракционного предела. Длина волны электрона уменьшается с увеличением его скорости. В электронном микроскопе с напряжением 100000 В длина волны электрона равна 0.004 нм. Согласно теории, разрешение такого микроскопа в пределе составляет 0.002 нм. Однако в реальности вследствие малой величины числовых апертур электронных линз разрешение современных электронных микроскопов в лучшем случае составляет 0,1 нм. Трудности приготовления образца, его повреждение излучением существенно снижают нормальное разрешение, которое для биологических объектов составляет 2 нм (примерно в 100 раз выше, чем у светового микроскопа).

Источником электронов в просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ) является нить катода, расположенная в вершине цилиндрической колонны высотой около двух метров. Чтобы избежать рассеивания электронов при столкновениях с молекулами воздуха, в колонне создается вакуум. Электроны, излучаемые катодной нитью, ускоряются ближайшим анодом и проникают через крошечное отверстие, формируя электронный луч, проходящий в нижнюю часть колонны. Вдоль колонны на некотором расстоянии расположены кольцевые магниты, фокусирующие электронный луч, подобно стеклянным линзам, фокусирующим луч света в оптическом микроскопе. Образец через воздушный шлюз помещают внутрь колонны, на пути электронного пучка. Часть электронов в момент прохождения через образец рассеивается в соответствии с плотностью вещества в данном участке, остаток электронов фокусируется и формирует изображение (подобно формированию изображения в оптическом микроскопе) на фотопластинке или на фосфоресцирующем экране.

Одним из самых больших недостатков электронной микроскопии является то, что биологические образцы необходимо подвергнуть специальной обработке. Во-первых, их фиксируют сначала глутаровым альдегидом, а затем осмиевой кислотой, связывающей и стабилизирующей двойной слой липидов и белков. Во-вторых, электроны обладают низкой проникающей способностью, поэтому приходится делать сверхтонкие срезы, а для этого образцы обезвоживают и пропитывают смолами. В-третьих, для усиления контраста образцы обрабатывают солями тяжелых металлов, такими как осмий, уран и свинец.

Для того, чтобы получить трехмерное изображение поверхности используется сканирующий электронный микроскоп (СЭМ) , где используются электроны, рассеиваемые или излучаемые поверхностью образца. Образец в данном случае фиксируют, высушивают и покрывают тонкой пленкой тяжелого металла, а затем сканируют узким пучком электронов. При этом оценивается количество электронов, рассеиваемых при облучении поверхности. Полученное значение используют для контроля интенсивности второго луча, движущегося синхронно первому и формирующему изображение на экране монитора. Разрешение метода около 10 нм и он не применим для изучения внутриклеточных органелл. Толщина образцов, изучаемых этим методом, определяется проникающей способностью электронов или их энергией.

Основными и существенными недостатками всех этих методов является длительность, сложность и высокая стоимость приготовления образца.

Сканирующая зондовая микроскопия

В сканирующем зондовом микроскопе (СЗМ) вместо электронного луча или оптического излучения используется острийный зонд, игла, сканирующая поверхность образца. Образно выражаясь, можно сказать, что если в оптическом или электронном микроскопах образец осматривается, то в СЗМ – ощупывается. В результате можно получать трехмерные изображения объектов в разных средах: вакууме, воздухе, жидкости.

Специальные конструкции СЗМ, адаптированные для биологических исследований, позволяют одновременно с оптическим наблюдением сканировать как живые клетки в разных жидких средах, так и фиксированные препараты на воздухе.

Сканирующий зондовый микроскоп

В названии сканирующего зондового микроскопа отражен принцип его действия – сканирование поверхности образца, при котором осуществляется поточечное считывание степени взаимодействия зонда с поверхностью. Размер области сканирования и количество точек в ней N X ·N Y можно задавать. Чем больше задается точек, тем с большим разрешением получается изображение поверхности. Расстояние между точками считывания сигнала называется шагом сканирования. Шаг сканирования должен быть меньше изучаемых деталей поверхности. Перемещение зонда в процессе сканирования (см. Рис. 7 -1) осуществляется линейно в прямом и в обратном направлении (в направлении быстрого сканирования), переход на следующую линию осуществляется в перпендикулярном направлении (в направлении медленного сканирования).

Рис. 7 1. Схематическое изображение процесса сканирования
(считывание сигнала осуществляется на прямом ходе сканера)

В зависимости от характера считываемого сигнала, сканирующие микроскопы имеют различные названия и назначения:

атомно-силовой микроскоп (АСМ), считываются силы межатомного взаимодействия между атомами зонда и атомами образца;

туннельный микроскоп (СТМ), считывается туннельный ток, протекающий между проводящим образцом и проводящим зондом;

магнитно-силовой микроскоп (МФМ), считываются силы взаимодействия между зондом, покрытым магнитным материалом, и обнаруживающим магнитные свойства образцом;

электростатический силовой микроскоп (ЭСМ) позволяет получать картину распределения электрического потенциала на поверхности образца. Используются зонды, кончик которых покрыт тонкой проводящей пленкой (золото или платина).

Конструкция СЗМ

СЗМ состоит из следующих основных компонентов (Рис 7 -2): зонда, пьезоэлектрических приводов для перемещения зонда по X, Y, Z над поверхностью исследуемого образца, цепи обратной связи и компьютера для управления процессом сканирования и получением изображения.

Рис 7 2. Схема сканирующего зондового микроскопа

Зондовый датчик – компонент силового зондового микроскопа, осуществляющий сканирование препарата. Зондовый датчик содержит кантилевер (пружинную консоль) прямоугольного (I- образного) или треугольного (V-образного) типов (Рис. 7 -3), на конце которого размещен острийный зонд (Рис. 7 -3), имеющий обычно конусную или пирамидальную форму. Другим концом кантилевер стыкуется с подложкой (с так назывемым чипом). Зондовые датчики изготавливаются из кремния или нитрида кремния. Основной характеристикой кантилевера является силовая константа (константа жесткости), она варьируется от 0.01 N/m до 1020 N/m. Для исследований биологических объектов используются “мягкие” зонды с жесткостью 0.01  0.06 N/m.

Рис. 7 3. Изображения пирамидальных АСМ зондовых датчиков
полученное с помощью электронного микроскопа:
а – I- образный тип, б – V- образный тип, с – пирамидка на кончике кантилевера

Пьезоэлектрические приводы или сканеры - для контролируемого перемещения зонда над образцом или самого образца относительно зонда на сверхмалых расстояниях. В пьезоэлектрических приводах используются пьезокерамические материалы, которые изменяют свои размеры при приложении к ним электрического напряжения. Процесс изменения геометрических параметров под действием электрического поля называется обратным пьезоэффектом. Наиболее распространенный пьезоматериал - цирконат-титанат свинца.

Сканер - конструкция из пьезокерамики, обеспечивающая перемещение по трем координатам: x, y (в латеральной плоскости образца) и z (по вертикали). Существует несколько типов сканеров, наиболее распространенными из которых являются триподные и трубчатые (Рис. 7 -4).

Рис. 7 4. Конструкции сканеров: а) – триподный, б) – трубчатый

В триподном сканере перемещения по трем координатам обеспечивают образующие ортогональную структуру три независимых пьезокерамических стержня.

В трубчатом сканере полая пьезоэлектрическая трубка изгибается в плоскостях XZ и ZY и удлиняется или сжимается по оси Z при подаче соответствующих напряжений на электроды, управляющие перемещениями трубки. Электроды для управления движением в плоскости XY расположены на наружной поверхности трубки, для управления перемещением по Z на X и Y электроды подаются равные напряжения.

Цепь обратной связи – совокупность элементов СЗМ, с помощью которой при сканировании зонд удерживается на фиксированном расстоянии от поверхности образца (Рис. 7 -5). В процессе сканирования зонд может находиться на участках поверхности образца с разным рельефом, при этом будет изменяться расстояние Z зонд-образец, соответственно будет изменяться и величина взаимодействия зонд-образец.

Рис. 7 5. Схема обратной связи сканирующего зондового микроскопа

При приближении зонда к поверхности возрастают силы взаимодействия зонд-образец, возрастает и сигнал регистрирующего устройства V (t ), который выражается в единицах напряжения. Компаратор сравнивает сигнал V (t ) с опорным напряжением V опорное и вырабатывает корректирующий сигнал V корр . Сигнал коррекции V корр подается на сканер, и зонд отводится от образца. Опорное напряжение – напряжение, соответствующее сигналу регистрирующего устройства, когда зонд оказывается на заданном расстоянии от образца. Поддерживая в процессе сканирования это заданное расстояние зонд-образец, система обратной связи поддерживает заданную силу взаимодействия зонд-образец.

Рис. 7 6. Траектория относительного движения зонда в процессе поддержания системой обратной связи постоянной силы взаимодействия зонд-образец

На Рис. 7 -6 показана траектория движения зонда относительно образца при сохранении постоянной силы взаимодействия зонд-образец. Если зонд оказывается над ямкой, на сканер подается напряжение, при котором сканер удлиняется, опуская зонд.

Быстрота отклика цепи обратной связи на изменение расстояния зонд-образец (взаимодействия зонд-образец) определяется константой цепи обратной связи K . Значения K зависят от особенностей конструкции конкретного СЗМ (конструкции и характеристик сканера, электроники), режима работы СЗМ (размера области сканирования, скорости сканирования и т.п.), а также особенностей исследуемой поверхности (масштаба особенностей рельефа, твердости материала и пр.).

Разновидности СЗМ

Сканирующий туннельный микроскоп

В СТМ регистрирующим устройством (Рис. 7 -7) измеряется туннельный ток, протекающий между металлическим зондом, который изменяется в зависимости от потенциала на поверхности образца и от рельефа его поверхности. Зонд представляет собой остро заточенную иглу, радиус закругления острия которой может достигать нескольких нанометров. В качестве материала для зонда обычно используются металлы с высокой твердостью и химической стойкостью: вольфрам или платина.

Рис. 7 7. Схема туннельного зондового датчика

Между проводящим зондом и проводящим образцом прикладывается напряжение. Когда кончик зонда оказывается на расстоянии около 10А от образца, электроны из образца начинают туннелировать через промежуток в зонд или наоборот, в зависимости от знака напряжения (Рис. 7 -8).

Рис. 7 8. Схематическое изображение взаимодействия кончика зонда с образцом

Возникающий при этом туннельный ток измеряется регистрирующим устройством. Его величина I Т пропорциональна приложенному к туннельному контакту напряжению V и экспоненциально зависит от расстояния от иглы до образца d .

Таким образом, малым изменениям расстояния от кончика зонда до образца d отвечают экспоненциально большие изменения туннельного тока I Т (предполагается, что напряжение V поддерживается постоянным). В силу этого чувствительность туннельного зондового датчика достаточна, чтобы зарегистрировать изменения высот менее 0,1 нм, и, следовательно, получить изображение атомов на поверхности твердого тела.

Атомно-силовой микроскоп

Наиболее распространенным зондовым датчиком атомно-силового взаимодействия является пружинный кантилевер (от англ. cantilever - консоль) с расположенным на его конце зондом. Величина изгиба кантилевера, возникающего вследствие силового взаимодействия между образцом и зондом (Рис 7 -9), измеряется с помощью оптической схемы регистрации.

Принцип действия силового датчика основан на использовании атомных сил, действующих между атомами зонда и атомами образца. При изменении силы зонд-образец меняется величина изгиба кантилевера, и такое изменение измеряется оптической системы регистрации. Таким образом, атомно-силовой датчик представляет собой острийный зонд с высокой чувствительностью, позволяющей регистрировать силы взаимодействия между отдельным атомами.

При малых изгибах соотношение между силой зонд-образец F и отклонением кончика кантилевера x определяется законом Гука:

где k – силовая константа (константа жесткости) кантилевера.

Например, если используется кантилевер с константой k порядка 1 н/м, то под действием силы взаимодействия зонд-образец порядка 0.1 наноньютона величина отклонения кантилевера составит примерно 0.1 нм.

Для измерения столь малых перемещений обычно используется оптический датчик смещений (Рис 7 -9), состоящий из полупроводникового лазера и четырехсекционного фотодиода. При изгибе кантилевера отраженный от него луч лазера смещается относительно центра фотодетектора. Таким образом, изгиб кантилевера может быть определен по относительному изменению освещенности верхней (T)и нижней (B) половинок фотодетектора.

Рис 7 9. Схема силового датчика

Зависимость сил взаимодействия зонд-образец от расстояния зонд-образец

При приближении зонда к образцу он сначала притягивается к поверхности благодаря наличию притягивающих сил (силы Ван-дер-Ваальса). При дальнейшем приближении зонда к образцу электронные оболочки атомов на конце зонда и атомов на поверхности образца начинают перекрываться, что приводит к появлению отталкивающей силы. При дальнейшем уменьшении расстояния отталкивающая сила становится доминирующей.

В общем виде зависимость силы межатомного взаимодействия F от расстояния между атомами R имеет вид:

.

Константы a и b и показатели степени m и n зависят от сорта атомов и типа химических связей. Для сил Ван-дер-Ваальса m =7 и n=3 . Качественно зависимость F(R) показана на Рис. 7 -10.

Рис. 7 10.Зависимость силы взаимодействия между атомами от расстояния

Формат СЗМ - данных, визуализация СЗМ – данных

Данные о морфологии поверхности, полученные при исследовании на оптическом микроскопе, представляются в виде увеличенного изображения участка поверхности. Информация, получаемая с помощью СЗМ, записывается в виде двухмерного массива целых чисел A ij . Каждому значению ij соответствует определенная точка поверхности в пределах поля сканирования. Графическое отображение этого массива чисел называется СЗМ сканированным изображением.

Сканированные изображения могут быть как двумерными (2D), так и трехмерными (3D). При 2D визуализации каждой точке поверхности Z=f (x,y ) ставится в соответствие определенный цветовой тон в соответствии с высотой точки поверхности (Рис. 7 -11 а). При 3D визуализации изображение поверхности Z=f (x,y ) строится в аксонометрической перспективе с помощью определенным образом рассчитанных пикселей или линий рельефа. Наиболее эффективным способом раскраски 3D изображений является моделирование условий подсветки поверхности точечным источником, расположенным в некоторой точке пространства над поверхностью (Рис. 7 -11 б). При этом удается подчеркнуть отдельные малые особенности рельефа.

Рис. 7 11. Лимфоциты крови человека:
а) 2D-изображение, б) 3D изображение с боковой подсветкой

Подготовка образцов для СЗМ исследования

Морфология и структура бактериальных клеток

Бактерии – одноклеточные микроорганизмы, имеющие разнообразную форму и сложную структуру, определяющую многообразие их функциональной деятельности. Для бактерий характерны четыре основные формы: сферическая (шаровидная), цилиндрическая (палочковидная), извитая и нитевидная [Лит. 7 -2].

Кокки (бактерии шаровидной формы) – в зависимости от плоскости деления и расположения отдельных особей подразделяются на микрококки (отдельно лежащие кокки), диплококки (парные кокки), стрептококки (цепочки кокков), стафилококки (имеющие вид виноградных гроздьев), тетракокки (образования из четырех кокков) и сарцины (пакеты из 8 или 16 кокков).

Палочковидные – бактерии располагаются в виде одиночных клеток, дипло- или стрептобактерий.

Извитые – вибрионы, спириллы и спирохеты. Вибрионы имеют вид слегка изогнутых палочек, спириллы – извитую форму с несколькими спиральными завитками.

Размеры бактерий колеблются от 0.1 до 10 мкм. В состав бактериальной клетки входят капсула, клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана и цитоплазма. В цитоплазме находятся нуклеотид, рибосомы и включения. Некоторые бактерии снабжены жгутиками и ворсинками. Ряд бактерий образуют споры. Превышая исходный поперечный размер клетки, споры придают ей веретенообразную форму.

Для изучения морфологии бактерий на оптическом микроскопе из них готовят нативные (прижизненные) препараты или фиксированные мазки, окрашенные анилиновым красителем. Существуют специальные методы окраски для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеотида и разных цитоплазматических включений.

Для СЗМ исследования морфологии бактериальных клеток не требуется окрашивания препарата. СЗМ позволяет с высокой степенью разрешения определить форму и размер бактерий. При тщательном приготовлении препарата и использовании зонда с малым радиусом закругления возможно выявление жгутиков. В то же время из-за большой жесткости клеточной стенки бактерий нельзя «прощупать» внутриклеточные структуры, как это можно сделать на некоторых животных клетках.

Приготовление препаратов для СЗМ изучения морфологии

Для первого опыта работы с СЗМ рекомендуется выбрать биологический препарат, который не требует сложной подготовки. Вполне подойдут легкодоступные и непатогенные кисломолочные бактерии из рассола квашеной капусты или кисломолочных продуктов.

Для СЗМ исследования на воздухе требуется прочно зафиксировать исследуемый объект на поверхности подложки, например, на покровном стекле. Кроме того, плотность бактерий в суспензии должна быть такова, чтобы клетки при осаждении на подложку не слипались, и расстояние между ними было не слишком велико, чтобы при сканировании можно было в один кадр взять несколько объектов. Эти условия выполняются, если правильно выбрать режим приготовления образца. Если нанести каплю раствора, содержащего бактерии, на подложку, то будет происходить их постепенное осаждение и адгезия. Основными параметрами при этом следует считать концентрацию клеток в растворе и время осаждения. Концентрацию бактерий в суспензии определяют по оптическому стандарту мутности.

В нашем случае роль будет играть лишь один параметр – время инкубации. Чем дольше выдерживать каплю на стекле, тем больше окажется плотность бактериальных клеток. В то же время, если капля жидкости начнет подсыхать, то препарат будет слишком сильно загрязнен осадившимися компонентами раствора. Каплю раствора, содержащего бактериальные клетки (рассол), наносят на покровное стекло, выдерживают 5-60 минут (в зависимости от состава раствора). Затем, не дожидаясь высыхания капли, тщательно промывают дистиллированной водой (обмакивая препарат пинцетом в стакан несколько раз). После высушивания препарат готов для измерения на СЗМ.

Для примера приготовили препараты кисломолочных бактерий из рассола квашеной капусты. Время выдерживания капли рассола на покровном стекле выбрали 5 мин, 20 мин и 1 час (капля уже начала подсыхать). СЗМ - кадры представлены на Рис. 7 -12, Рис. 7 -13,
Рис. 7 -14.

Из рисунков видно, что для данного раствора оптимальное время инкубации 510 мин. Увеличение времени выдерживания капли на поверхности подложки приводит к слипанию бактериальных клеток. В случае же, когда капля раствора начинает подсыхать, наблюдается осаждение на стекло компонентов раствора, которые невозможно отмыть.

Рис. 7 12. Изображения кисломолочных бактерий на покровном стекле,
полученные с помощью СЗМ.

Рис. 7 13. Изображения кисломолочных бактерий на покровном стекле,
полученные с помощью СЗМ. Время инкубации раствора 20 мин

Рис. 7 14. Изображения кисломолочных бактерий на покровном стекле,
полученные с помощью СЗМ. Время инкубации раствора 1 час

На одном из отобранных препаратов (Рис. 7 -12) мы постарались рассмотреть, что же представляют собой кисломолочные бактерии, какая форма для них характерна в данном случае. (Рис. 7 -15)

Рис. 7 15. АСМ - изображение кисломолочных бактерий на покровном стекле.
Время инкубации раствора 5 мин

Рис. 7 16. АСМ - изображение цепочки кисломолочных бактерий на покровном стекле.
Время инкубации раствора 5 мин

Для рассола характерна форма бактерий палочковидной формы и расположение в виде цепочки.

Рис. 7 17. Окно управляющей программы учебного СЗМ NаnoEducator.
Панель инструментов

Используя инструменты программы учебного СЗМ NаnoEducator мы определили размеры бактериальных клеток. Они составили примерно от 0.5 × 1.6 мкм
до 0.8 × 3.5 мкм.

Полученные результаты сопоставляем с данными, приведенными в определителе бактерий Берджи [Лит. 7 -3].

Кисломолочные бактерии относятся к лактобактериям (Lactobacillus). Клетки имеют вид палочек, обычно правильной формы. Палочки длинные, иногда почти кокковидные, обычно в коротких цепочках. Размеры 0,5 - 1,2 Х 1,0 - 10 мкм. Спор не образуют; в редких случаях подвижны за счет перитрихиальных жгутиков. Широко распространены в окружающей среде, особенно часто встречаются в пищевых продуктах животного и растительного происхождения. Кисломолочные бактерии входят в нормальную микрофлору пищеварительного тракта. Всем известно, что квашеная капуста, помимо содержания в ней витаминов, полезна для улучшения микрофлоры кишечника.

Конструкция сканирующего зондового микроскопа NanoEducator

На Рис. 7 -18 представлен внешний вид измерительной головки СЗМ NanoEducator и обозначены основные элементы прибора, используемые при работе.

Рис. 7 18. Внешний вид измерительной головки СЗМ NanoEducator
1- основание, 2-держатель образца, 3- Датчик взаимодействия, 4-винт фиксации датчика,
5-винт ручного подвода, 6-винты перемещения сканера с образцом в горизонтальной плоскости, 7-защитная крышка с видеокамерой

На Рис. 7 -19 представлена конструкция измерительной головки. На основании 1 расположены сканер 8 с держателем образца 7 и механизм подвода образца к зонду 2 на основе шагового двигателя. В учебном СЗМ NanoEducator образец закрепляется на сканер, и осуществляется сканирование образцом относительно неподвижного зонда. Подвод зонда 6, закрепленного на датчике силового взаимодействия 4, к образцу можно также осуществлять с помощью винта ручного подвода 3. Предварительный выбор места исследования на образце осуществляется с помощью винта 9.

Рис. 7 19. Конструкция СЗМ NanoEducator: 1 – основание, 2 – механизм подвода,
3 – винт ручного подвода, 4 – датчик взаимодействия, 5 – винт фиксации датчика, 6 – зонд,
7 – держатель образца, 8 – сканер, 9, 10 – винты перемещения сканера с образцом

Учебный СЗМ NanoEducator состоит из соединенных кабелями измерительной головки, СЗМ контроллера и управляющего компьютера. Микроскоп оснащен видеокамерой. Сигнал от датчика взаимодействия после преобразования в предусилителе поступает в СЗМ контроллер. Управление работой СЗМ NanoEducator осуществляется от компьютера через СЗМ контроллер.

Датчик силового взаимодействия и зонд

В приборе NanoEducator датчик выполнен в виде пьезокерамической трубки длиной l =7 мм, диаметром d =1,2 мм и толщиной стенки h =0,25 мм, жестко закрепленной с одного конца. На внутреннюю поверхность трубки нанесен проводящий электрод. На внешнюю поверхность трубки нанесены два электрически изолированных полуцилиндрических электрода. К свободному концу трубки прикреплена вольфрамовая проволока диаметром
100 мкм (Рис. 7 -20).

Рис. 7 20. Конструкция универсального датчика прибора NanoEducator

Свободный конец проволоки, использующейся в качестве зонда, заточен электрохимически, радиус закругления имеет величину 0.2  0.05 мкм. Зонд имеет электрический контакт с внутренним электродом трубки, соединенным с заземленным корпусом прибора.

Наличие двух внешних электродов на пьезоэлектрической трубке позволяет в качестве датчика силового взаимодействия (датчика механических колебаний) использовать одну часть пьезоэлектрической трубки (верхнюю, в соответствии с Рис. 7 -21), а другую часть использовать в качестве пьезовибратора. К пьезовибратору подводится переменное электрическое напряжение с частотой, равной резонансной частоте силового датчика. Амплитуда колебаний при большом расстоянии зонд-образец максимальна. Как видно из Рис. 7 -22, в процессе колебаний зонд отклоняется от равновесного положения на величину А о, равную амплитуде его вынужденных механических колебаний (она составляет доли микрометра), при этом на второй части пьезотрубки (датчике колебаний) возникает переменное электрическое напряжение, пропорциональное смещению зонда, которое и измеряется прибором.

При приближении зонда к поверхности образца зонд начинает касаться образца в процессе колебаний. Это приводит к смещению амплитудно-частотной характеристики (АЧХ) колебаний датчика влево по сравнению с АЧХ, измеренной вдали от поверхности (Рис. 7 -22). Так как частота вынуждающих колебаний пьезотрубки поддерживается постоянной и равной частоте колебаний  о в свободном состоянии, то при приближении зонда к поверхности амплитуда его колебаний уменьшается и становится равной A. Эта амплитуда колебаний регистрируется со второй части пьезотрубки.

Рис. 7 21. Принцип работы пьезоэлектрической трубки
в качестве датчика силового взаимодействия

Рис. 7 22. Изменение частоты колебаний силового датчика
при приближении к поверхности образца

Сканер

Способ организации микроперемещений, использующийся в приборе NanoEducator , основан на использовании зажатой по периметру металлической мембраны, к поверхности которой приклеена пьезопластинка (Рис. 7 -23 а). Изменение размеров пьезопластинки под действием управляющего напряжения будет приводить к изгибу мембраны. Расположив такие мембраны по трем перпендикулярным сторонам куба и соединив их центры металлическими толкателями, можно получить 3 х -координатный сканер (Рис. 7 -23 б).

Рис. 7 23. Принцип действия (а) и конструкция (б) сканера прибора NanoEducator

Каждый пьезоэлемент 1, закрепленный на гранях куба 2, при приложении к нему электрического напряжения может передвигать прикрепленный к нему толкатель 3 в одном из трех взаимно перпендикулярных направлений – X, Y или Z. Как видно из рисунка, все три толкателя соединены в одной точке 4. С некоторым приближением можно считать, что эта точка перемещается по трем координатам X, Y, Z . К этой же точке прикрепляется стойка 5 с держателем образца 6. Таким образом, образец перемещается по трем координатам под действием трех независимых источников напряжения. В приборах NanoEducator максимальное перемещение образца составляет около 5070 мкм, что и определяет максимальную площадь сканирования.

Механизм автоматизированного подвода зонда к образцу (захват обратной связи)

Диапазон перемещений сканера по оси Z составляет около 10 мкм, поэтому перед началом сканирования необходимо приблизить зонд к образцу на это расстояние. Для этого предназначен механизм подвода, схема которого приведена на Рис. 7 -19. Шаговый двигатель 1 при подаче на него электрических импульсов вращает винт подачи 2 и перемещает планку 3 с зондом 4, приближая или отдаляя его от образца 5, установленного на сканере 6. Величина одного шага составляет около 2 мкм.

Рис. 7 24. Схема механизма подвода зонда к поверхности образца

Так как шаг механизма подвода значительно превосходит величину требуемого расстояния зонд-образец в процессе сканирования, то во избежание деформации зонда его подвод осуществляется при одновременной работе шагового двигателя и перемещениям сканера по оси Z по следующему алгоритму:

1. Система обратной связи отключается и сканер “втягивается”, т. е. опускает образец в нижнее крайнее положение.

2. Механизм подвода зонда производит один шаг и останавливается.

3. Система обратной связи включается, и сканер плавно поднимает образец, одновременно производится анализ наличия взаимодействия зонд-образец.

4. Если взаимодействие отсутствует, процесс повторяется с пункта 1.

Если во время вытягивания сканера вверх появится ненулевой сигнал, система обратной связи остановит движение сканера вверх и зафиксирует величину взаимодействия на заданном уровне. Величина силового взаимодействия, при котором произойдет остановка подвода зонда и будет происходить процесс сканирования, в приборе NanoEducator характеризуется параметром Подавление амплитуды (Amplitude Suppression ) :

A=A o . (1- Amplitude Suppression)

Получение СЗМ–изображения

После вызова программы NanoEducator на экране компьютера появляется главное окно программы (Рис. 7 -20). Работу следует начать с пункта меню Файл и в нем выбрать Открыть или Новый либо соответствующие им кнопки на панели инструментов (, ).

Выбор команды Файл  Новый означает переход к проведению СЗМ измерений, а выбор команды Файл  Открыть означает переход к просмотру и обработке ранее полученных данных. Программа позволяет осуществлять просмотр и обработку данных параллельно с измерениями.

Рис. 7 25. Главное окно программы NanoEducator

После выполнения команды Файл  Новый на экране появляется окно диалога, которое позволяет выбрать или создать рабочую папку, в который по умолчанию будут записываться результаты текущего измерения. В процессе проведения измерений все полученные данные последовательно записываются в файлы с именами ScanData+i.spm , где индекс i обнуляется при запуске программы и наращивается при каждом новом измерении. Файлы ScanData+i.spm помещаются в рабочую папку, который устанавливается перед началом измерений. Существует возможность выбора другой рабочей папки во время проведения измерений. Для этого необходимо нажать кнопку , расположенную на панели инструментов главного окна программы и выбрать пункт меню Изменить рабочую папку .

Для сохранения результатов текущего измерения необходимо нажать кнопку Сохранить как в Окне сканирования в появившемся окне диалога выбрать папку и указать имя файла, при этом файл ScanData+i.spm , который служит временным файлом сохранения данных в процессе проведения измерений, будет переименован в заданное вами имя файла. По умолчанию файл будет сохранен в рабочей папке, назначенном перед началом измерений. Если не выполнить операцию сохранения результатов измерений, то при следующем запуске программы результаты, записанные во временных файлах ScanData+i.spm , будут последовательно перезаписываться (если не изменена рабочая папка). О наличии временных файлов результатов измерений в рабочей папке выдается предупреждение перед закрытием и после запуска программы. Смена рабочей папки перед началом проведения измерений позволяет защитить результаты предыдущего эксперимента от удаления. Стандартное имя ScanData можно изменить, задав его в окне выбора рабочей папке. Вызов окна выбора рабочей папки происходит при нажатии кнопки , расположенной на панели инструментов главного окна программы. Сохранить результаты измерений можно также в окне Браузер сканов , поочередновыделяя необходимые файлы и сохраняя их в выбранной папке.

Существует возможность экспорта результатов, полученных при помощи прибора NanoEducator в ASCII формат и формат Nova (фирма НТМДТ), который может быть импортирован программой НТ МДТ Nova, Image Analysis и другими программами. В ASCII формат экспортируются изображения сканов, данные их сечений, результаты измерения спектроскопии. Для экспорта данных необходимо нажать кнопку Экспорт , расположенную в инструментальной панели главного окна программы, либо выбрать Экспорт в пункте меню Файл этого окна и выбрать соответствующий формат экспорта. Данные для обработки и анализа можно сразу послать в предварительно запущенную программу Image Analysis.

После закрытия окна диалога на экран выводится панель управления прибором
(Рис. 7 -26).

Рис. 7 26. Панель управления прибором

В левой части панели управления прибором расположены кнопки выбора конфигурации СЗМ:

ССМ – сканирующий силовой микроскоп (ССМ)

СТМ – сканирующий туннельный микроскоп (СТМ).

Проведение измерений на учебном СЗМ NanoEducator заключается в выполнении следующих операций:

1. Установка образца

ВНИМАНИЕ! Перед установкой образца необходимо снять датчик с зондом, чтобы не повредить зонд.

Предусмотрено два способа крепления образца:

на магнитном столике (в этом случае образец должен быть прикреплен к магнитной подложке);

на двусторонней липкой ленте.

ВНИМАНИЕ! Для установки образца на двусторонней липкой ленте, необходимо вывинтить держатель из стойки (чтобы не повредить сканер), а затем вновь ввинтить его до легкого упора.

В случае магнитного крепления замена образца может производиться без отвинчивания держателя образца.

2. Установка зондового датчика

ВНИМАНИЕ! Устанавливать датчик с зондом следует всегда после установки образца.

Выбрав нужный зондовый датчик (держите датчик за металлические кромки основания) (см. Рис. 7 -27), ослабьте винт фиксации зондового датчика 2 на крышке измерительной головки, вставьте датчик в гнездо держателя до упора, завинтите винт фиксации по часовой стрелке до легкого упора.

Рис. 7 27. Установка зондового датчика

3. Выбор места сканирования

При выборе на образце участка для исследования используйте винты перемещения двухкоординатного столика, расположенного в нижней части прибора.

4. Предварительный подвод зонда к образцу

Операция предварительного подвода не является обязательной для каждого измерения, необходимость ее выполнения зависит от величины расстояния между образцом и острием зонда. Операцию предварительного сближения желательно производить, если расстояние между кончиком зонда и поверхностью образца превышает 0.51 мм. При использовании автоматизированного подвода зонда к образцу с большого расстояния между ними процесс подвода займет очень много времени.

Воспользуйтесь винтом ручного подвода для опускания зонда, контролируя расстояние между ним и поверхностью образца визуально.

5. Построение резонансной кривой и установка рабочей частоты

Эта операция обязательно выполняется в начале каждого измерения и, пока она не произведена, переход к дальнейшим этапам измерений заблокирован. Кроме того, в процессе измерений иногда возникают ситуации, требующие повторного выполнения этой операции (например, при потере контакта).

Окно поиска резонанса вызывается нажатием кнопки панели управления прибором. Выполнение этой операции предусматривает измерение амплитуды колебаний зонда при изменении частоты вынужденных колебаний, задаваемых генератором. Для этого необходимо нажать кнопку RUN (Рис. 7 -28).

Рис. 7 28. Окно операции поиска резонанса и установки рабочей частоты:
а) – автоматический режим, б) – ручной режим

В режиме Авто автоматически устанавливается частота генератора, равная частоте, при которой наблюдалась максимальная амплитуда колебаний зонда. График, демонстрирующий изменение амплитуды колебаний зонда в заданном диапазоне частот (Рис. 7 -28а), позволяет наблюдать форму резонансного пика. Если резонансный пик недостаточно ярко выражен, или амплитуда при частоте резонанса мала (менее 1В ), то необходимо изменить параметры проведения измерений и повторно провести определение резонансной частоты.

Для этого предназначен режим Ручной . При выборе этого режима в окне Определение резонансной частоты появляется дополнительная панель
(Рис. 7 -28б), позволяющая корректировать следующие параметры:

Напряжение раскачки зонда , задаваемых генератором. Рекомендуется устанавливать эту величину минимальной (вплоть до нуля) и не более 50 мВ.

Коэффициент усиления амплитуды (Усиление амплитуды ). При недостаточной величине амплитуды колебаний зонда (<1 В) рекомендуется увеличить коэффициент Усиление амплитуды .

Для начала операции поиска резонанса необходимо нажать кнопку Старт .

Режим Ручной позволяет вручную менять выбранную частоту, передвигая зеленый курсор на графике с помощью мыши, а также уточнить характер изменения амплитуды колебаний в узком диапазоне значений вокруг выбранной частоты (для этого необходимо установить переключатель Ручной режим в положение Точно и нажать кнопку Старт ).

6. Захват взаимодействия

Для захвата взаимодействия выполняется процедура контролируемого сближения зонда и образца с помощью механизма автоматизированного подвода. Окно управления этой процедурой вызывается нажатием кнопки панели управления прибором. При работе с ССМ эта кнопка становится доступной после выполнения операции поиска и установки резонансной частоты. Окно ССМ, Подвод (Рис. 7 -29) содержит элементы управления подводом зонда, а также индикации параметров, которые позволяют анализировать ход выполнения процедуры.

Рис. 7 29. Окно процедуры подвода зонда

В окне Подвод пользователь имеет возможность наблюдать за следующими величинами:

удлинением сканера (Сканер Z ) по оси Z относительно максимально возможной, принятой за единицу. Величина относительного удлинения сканера характеризуется уровнем заполнения левого индикатора цветом, соответствующим зоне, в которой находится сканер в текущий момент: зеленый цвет – рабочая зона, синий – вне рабочей зоны, красный – сканер подошел слишком близко к поверхности образца, что может повлечь деформацию зонда. В последнем случае программа выдает звуковое предупреждение;

амплитудой колебаний зонда относительно амплитуды его колебаний в отсутствии силового взаимодействия, принятой за единицу. Величина относительной амплитуды колебаний зонда показана на правом индикаторе уровнем его заполнения бордовым цветом. Горизонтальная метка на индикаторе Амплитудой колебаний зонда указывает на уровень, при переходе через который производится анализ состояния сканера и его автоматический вывод в рабочее положение;

количество шагов (Ш аги ), пройденных в заданном направлении: Подвод – сближение, Отвод – удаление.

До начала процесса опускания зонда необходимо:

Проверить правильность установок параметров сближения:

Коэффициент усиления в цепи обратной связи Усиление ОС установлен на значении 3 ,

Убедиться, что параметр Подавление амплитуды (Сила) имеет величину около 0,2 (см. Рис. 7 -29). В противном случае нажать кнопку Сила и в окне Установка параметров взаимодействия(Рис. 7 -30) установитьзначениеПодавление амплитуды равное 0.2. Для более деликатного подводазначение параметраПодавление амплитуды может быть меньше.

Проверить правильность установок в окне параметров Параметры , страница Параметры подвода .

Имеется взаимодействие или нет, можно определить по левому индикатору Сканер Z . Полное удлинение сканера (весь индикатор Сканер Z окрашен синим цветом), а также полностью закрашенный бордовым цветом индикатор Амплитуда колебаний зонда (Рис. 7 -29) указывают на отсутствие взаимодействия. После выполнения поиска резонанса и установки рабочей частоты амплитуда свободных колебаний зонда принимается за единицу.

Если же сканер удлинен не полностью до или во время сближения, либо программа выдает сообщение: ‘Ошибка! Зонд слишком близок к образцу. Проверьте параметры подвода или физический узел. Вы хотите отойти в безопасное место" , то рекомендуется приостановить выполнение процедуры подвода и:

a. изменить один из параметров:

увеличить величину взаимодействия, параметр Подавление амплитуды , либо

увеличить значение Усиление ОС , либо

увеличить время задержки между шагами сближения (параметр Время интегрирования на странице Параметры подвода окна Параметры ).

b. увеличить расстояние между острием зонда и образцом (для этого выполнить действия, описанные в пункте и выполнить операцию Резонанс , после чего вернуться к выполнению процедуры Подвод .

Рис. 7 30. Окно установки величины взаимодействия зонда и образца

После захвата взаимодействия появляется сообщение “Подвод выполнен” .

При необходимости осуществить сближение на один шаг, следует нажать кнопку . В этом случае сначала выполняется шаг, а потом осуществляется проверка критериев захвата взаимодействия. Для остановки движения необходимо нажать кнопку . Для выполнения операции отвода необходимо нажать кнопку для быстрого отвода

или нажать кнопку для медленного отвода. При необходимости осуществить отвод на один шаг, следует нажать кнопку . В этом случае сначала выполняется шаг, а потом осуществляется проверка критериев захвата взаимодействия

7. Сканирование

После выполнения процедуры подвода (Подвод ) и захвата взаимодействия становится доступным сканирование (кнопка в окне панели управления прибором).

Нажав эту кнопку (вид окна сканирования представлен на Рис. 7 -31), пользователь приступает непосредственно к проведению измерений и получению результатов измерений.

Перед проведением процесса сканирования необходимо установить параметры сканирования. Эти параметры сгруппированы в правой части верхней панели окна Сканирование .

В первый раз после запуска программы они устанавливаются по умолчанию:

Площадь сканирования - Область (X нм* Y нм) : 5000*5000 нм;

Количество точек измерений по осям - X, Y: NX =100, NY =100;

Путь сканирования - Направление определяет направление сканирования. Программа позволяет выбирать направление оси быстрого сканирования (Х или Y). При запуске программы устанавливается Направление

После задания параметров сканирования необходимо нажать кнопку Применить для подтверждения ввода параметров и кнопку Старт для начала сканирования.

Рис. 7 31. Окно управления процессом и отображения результатов сканирования ССМ

7.4.Методические указания

Прежде чем приступить к работе на сканирующем зондовом микроскопе NanoEducator следует изучить руководство пользователя прибора [Лит. 7 -4].

7.5.Техника безопасности

Для питания прибора используется напряжение 220 В. Эксплуатацию сканирующего зондового микроскопа NanoEducator производить в соответствии с ПТЭ и ПТБ электроустановок потребителей напряжением до 1000 В.

7.6.Задание

1. Подготовьте самостоятельно биологические образцы для исследований методом СЗМ.

2. Изучите на практике общую конструкцию прибора NanoEducator.

3. Познакомьтесь с программой управления прибором NanoEducator.

4. Получите первое СЗМ изображение под контролем преподавателя.

5. Проведите обработку и анализ полученного изображения. Какие формы бактерий характерны для вашего раствора? Чем определяется форма и размеры бактериальных клеток?

6. Возьмите Определитель бактерий Берджи и сравните полученные результаты с описанными там.

7.7.Контрольные вопросы

1. Какие существуют методы исследования биологических объектов?

2. Что такое сканирующая зондовая микроскопия? Какой принцип лежит в ее основе?

3. Назовите основные компоненты СЗМ и их назначение.

4. Что такое пьезоэлектрический эффект и как он применяется в СЗМ. Опишите различные конструкции сканеров.

5. Опишите общую конструкцию прибора NanoEducator.

6. Опишите датчик силового взаимодействия и принцип его действия.

7. Опишите механизм подвода зонда к образцу в приборе NanoEducator. Поясните параметры, определяющие силу взаимодействия зонда с образцом.

8. Объясните принцип сканирования и работы системы обратной связи. Расскажите о критериях выбора параметров сканирования.

7.8.Литература

Лит. 7 1. Поль де Крюи. Охотники за микробами. М. Терра. 2001.

Лит. 7 2. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Под ред Егорова Н.С. М.: Наука, 1995.

Лит. 7 3. Хоулт Дж., Криг Н., П. Снит, Дж. Стейли, С. Уильямс. // Определитель бактерий Берджи. М.:Мир, 1997. Т.№ 2. C. 574.

Лит. 7 4. Руководство пользователя прибора NanoEducator .объектов . Нижний Новгород. Научно-образовательный центр...

Конспект лекций по курсу " Сканирующая зондовая микроскопия в биологии" План лекций

Конспект

... Сканирующая зондовая микроскопия в биологии" План лекций: Введение, история СЗМ. границы применения ... и наноструктур, исследовании биологических объектов : Нобелевские лауреаты... для исследования конкретного образца: В сканирующей зондовой микроскопии для ...

Предварительная программа xxiii российской конференции по электронной микроскопии 1 июня вторник утро 10 00 – 14 00 открытие конференции вступительное слово

Программа

Б.П. Караджян, Ю.Л. Иванова, Ю.Ф. Ивлев, В.И. Попенко Применение зондовой и конфокальной сканирующей микроскопии для исследования процессов репарации с использованием нанодисперсных трансплантатов...

1 -я Всероссийская научная конференция Методы исследования состава и структуры функциональных материалов

Документ

МНОГОЭЛЕМЕНТНЫХ ОБЪЕКТОВ БЕЗЭТАЛОННЫМ... Ляхов Н.З. ИССЛЕДОВАНИЯ НАНОКОМПОЗИТОВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ... Алиев В.Ш. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ЗОНДОВОЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭФФЕКТА... СКАНИРУЮЩЕЙ КАЛОРИМЕТРИИ И ТЕРМОСТИМУЛИРОВАННЫХ ТОКОВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ...

Лабораторная работа №1

Получение первого СЗМ изображения. Обработка и представление

Результатов эксперимента

Цель работы: изучение основ сканирующей зондовой микроскопии, конструкции и принципов работы прибора NanoEducator, получение первого СЗМ изображения, получение навыков обработки и представления экспериментальных результатов.

Приборы и принадлежности: прибор NanoEducator, образец для исследования: тестовый образец TGZ3 или любой другой по выбору преподавателя.

КРАТКАЯ ТЕОРИЯ

Общая конструкция сканирующего зондового микроскопа

СЗМ состоит из следующих основных компонентов (Рис. 1-1): 1 – зонд; 2 – образец; 3 – пьезоэлектрические двигатели x, y, z для прецизионного перемещения зонда над поверхностью исследуемого образца; 4 – генератор развертки, подающий напряжения на пьезодрайверы x и y, обеспечивающие сканирование зонда в горизонтальной плоскости; 5 – электронный датчик, детектирующий величину локального взаимодействия между зондом и образцом; 6 – компаратор, сравнивающий текущий сигнал в цепи датчика V(t) с изначально заданным V S , и, при его отклонении, вырабатывающий корректирующий сигнал V fb ; 7 – электронная цепь обратной связи, управляющая положением зонда по оси z; 8 – компьютер, управляющий процессом сканирования и получением изображения (9).

Рис. 1-1. Общая схема сканирующего зондового микроскопа. 1 – зонд; 2 – образец; 3 – пьезоэлектрические двигатели x, y, z; 4 – генератор напряжения развертки на x, y пьезокерамики; 5 – электронный датчик; 6 – компаратор; 7 – электронная цепь обратной связи; 8 – компьютер; 9 – изображение z(x,y)

Виды датчиков. Двумя основными методами зондовой микроскопии являются сканирующая туннельная микроскопия и атомно-силовая микроскопия.

При измерении туннельного тока в туннельном датчике (Рис. 1-2) используется преобразователь ток-напряжение (ПТН), включенный в цепь протекания тока между зондом и образцом. Возможны два варианта включения: с заземленным зондом, когда напряжение смещения подается на образец относительно заземленного зонда или с заземленным образцом, когда напряжение смещения прикладывается к зонду.

Традиционным датчиком силового взаимодействия является кремниевая микробалка, консоль или кантилевер (от англ. cantilever – консоль) с оптической схемой регистрации величины изгиба кантилевера, возникающего вследствие силового взаимодействия между образцом и зондом, расположенным на конце кантилевера (Рис. 1-3).

Рис. 1-2. Схема туннельного датчика Рис. 1-3. Схема силового датчика

Различают контактный, неконтактный и прерывисто-контактный («полуконтактный») способы проведения силовой микроскопии. Использование контактного способа предполагает, что зонд упирается в образец. При изгибе кантилевера под действием контактных сил отраженный от него луч лазера смещается относительно центра квадрантного фотодетектора. Таким образом, отклонение кантилевера может быть определено по относительному изменению освещенности верхней и нижней половинок фотодетектора.

При использование неконтактного способа зонд удален от поверхности и находится в области действия дальнодействующих притягивающих сил. Силы притяжения и их градиенты слабее отталкивающих контактных сил. Поэтому для их детектирования обычно используется модуляционная методика. Для этого с помощью пьезовибратора кантилевер раскачивается по вертикали на резонансной частоте. Вдали от поверхности амплитуда колебаний кантилевера имеет максимальную величину. По мере приближения к поверхности вследствие действия градиента сил притяжения резонансная частота колебаний кантилевера изменяется, при этом уменьшается амплитуда его колебаний. Эта амплитуда регистрируется с помощью оптической системы по относительному изменению переменной освещенности верхней и нижней половинок фотодетектора.

При «полуконтактном» способе измерений также применяется модуляционная методика измерения силового взаимодействия. В «полуконтактном» режиме зонд частично касается поверхности, находясь попеременно как в области притяжения, так и в области отталкивания.

Пьезоэлектрический двигатель. Сканеры. Для контролируемого перемещения иглы на сверхмалых расстояниях в СЗМ используются пьезоэлектрические двигатели. Их задача – обеспечить прецизионное механическое сканирование зондом исследуемого образца путем перемещения зонда относительно неподвижного образца или перемещения образца относительно неподвижного зонда. Работа большинства пьезоэлектрических двигателей, применяемых в современных СЗМ, основана на использовании обратного пьезоэффекта, который заключается в изменении размеров пьезоматериала под действием электрического поля. Основой большинства применяемых в СЗМ пьезокерамик является состав Pb(ZrTi)O 3 (цирконат-титанат свинца) с различными добавками.

Удлинение закрепленной с одного конца пьезопластинки определяется выражением:

где l – длина пластины, h – толщина пластины, U – электрическое напряжение, приложенное к электродам, расположенным на гранях пьезопластины, d 31 – пьезомодуль материала.

Конструкции из пьезокерамик, обеспечивающие перемещение по трем координатам x, y (в латеральной плоскости образца) и z (по вертикали), называются «сканерами». Существует несколько типов сканеров, наиболее распространенными из которых являются треногий и трубчатый (Рис. 1-4).

Рис. 1-4. Основные конструкции сканеров: а) – треногий, б) – трубчатый

В треногом сканере перемещения по трем координатам обеспечивают расположенные в ортогональную структуру три независимые пьезокерамики. Трубчатые сканеры работают посредством изгиба полой пьезоэлектрической трубки в латеральной плоскости и удлинения или сжатия трубки по оси Z. Электроды, управляющие перемещениями трубки в X и Y направлениях, размещаются в виде четырех сегментов по наружной поверхности трубки (Рис. 1-4 б). Для изгиба трубки в направлении X, на +X керамику подается напряжение для удлинения одной из ее сторон. Тот же самый принцип используется для задания движения в направлении Y. Смещения в X и Y направлениях

пропорциональны приложенному напряжению и квадрату длины трубки. Движение в Z направлении генерируется подачей напряжения на электрод в центре трубки. Это приводит к удлинению всей трубки пропорционально ее длине и приложенному напряжению.

Процесс сканирования поверхности в СЗМ (Рис. 1-5) имеет сходство с движением электронного луча по экрану в электроннолучевой трубке телевизора. Зонд движется вдоль линии (строки) сначала в прямом, а потом в обратном направлении (строчная развертка), затем переходит на следующую строку (кадровая развертка). Движение зонда осуществляется с помощью сканера небольшими шагами под действием пилообразных напряжений, подаваемых с генератора развертки (обычно, цифро-аналогового преобразователя). Регистрация информации о рельефе поверхности производится, как правило, на прямом проходе.

Рис. 1-5. Схематическое изображение процесса сканирования

К числу основных параметров, выбираемых перед началом сканирования, относятся:

Размер скана;

Число точек на линии N X и линий в скане N Y , определяющие шаг сканирования Δ;

Скорость сканирования.

Параметры сканирования выбираются исходя из предварительных данных (размера характерных поверхностных особенностей), которые имеются у исследователя об объекте исследования.

При выборе размера скана необходимо получить наиболее полную информацию о поверхности образца, т.е. отобразить наиболее характерные особенности его поверхности. Например, при сканировании дифракционной решетки с периодом 3 мкм необходимо отобразить хотя бы несколько периодов, т.е. размер скана должен составлять 10 - 15 мкм. В случае если расположение особенностей на поверхности исследуемого объекта неоднородно, то для достоверной оценки необходимо провести сканирование в нескольких отстоящих друг от друга точках на поверхности образца. При отсутствии информации об объекте исследования сначала, как правило, проводят сканирование в области, близкой к максимально доступной для отображения, с целью получения обзорной информации о характере поверхности. Выбор размера скана при повторном сканировании осуществляют исходя из данных, полученных на обзорном скане.

Число точек сканирования (N X , N Y) выбирается таким образом, чтобы шаг сканирования Δ (расстояние между точками, в которых производится считывание информации о поверхности) был меньше характерных ее особенностей, иначе произойдет потеря части информации, заключенной между точками сканирования. С другой стороны, выбор излишнего количества точек сканирования приведет к увеличению времени получения скана.

Скорость сканирования определяет скорость движения зонда между точками, в которых производится считывание информации. Излишне большая скорость может привести к тому, что система обратной связи не будет успевать отводить зонд от поверхности, что приведет к неправильному воспроизведению вертикальных размеров, а так же к повреждению зонда и поверхности образца. Малая скорость сканирования приведет к увеличению времени получения скана.

Система обратной связи. В процессе сканирования зонд может находиться над участками поверхности, имеющими различные физические свойства, в результате чего величина и характер взаимодействия зонд-образец будут изменяться. Кроме того, если на поверхности образца есть неровности, то при сканировании будет изменяться и расстояние ΔZ между зондом и поверхностью, соответственно будет изменяться и величина локального взаимодействия.

В процессе сканирования производится поддержание постоянной величины локального взаимодействия (силы или туннельного тока) с помощью системы отрицательной обратной связи. При приближении зонда к поверхности сигнал датчика возрастает (см. Рис. 1-1). Компаратор сравнивает текущий сигнал датчика с опорным напряжением V s и вырабатывает корректирующий сигнал V fb , используемый в качестве управляющего для пьезопривода, который отводит зонд от поверхности образца. Сигнал для получения изображения топографии поверхности берется при этом из канала z-пьезопривода.

На Рис. 1-6 показана траектория движения зонда относительно образца (кривая 2) и образца относительно зонда (кривая 1) при сохранении постоянной величины взаимодействия зонд-образец. Если зонд оказывается над ямкой или областью, где взаимодействие слабее, то образец приподнимается, в противном случае - образец опускается.

Отклик системы обратной связи на возникновение сигнала рассогласования V fb =V(t) – V S определяется константой цепи обратной связи K (в приборе NanoEducator - Усиление ОС ) или несколькими такими константами. Конкретные значения K зависят от особенностей конструкции конкретного СЗМ (конструкции и характеристик сканера, электроники), режима работы СЗМ (размера скана, скорости сканирования и т.п.), а также особенностей исследуемой поверхности (степень шероховатости, масштаб особенностей топографии, твердость материала и пр.).

Рис. 1-6. Траектория относительного движения зонда и образца в процессе поддержания системой обратной связи постоянного локального взаимодействия

В целом, чем больше значение K тем точнее цепь обратной связи отрабатывает черты сканируемой поверхности и тем достовернее данные, получаемые при сканировании. Однако при превышении некоторого критического значения K система обратной связи проявляет склонность к самовозбуждению, т.е. на линии скана наблюдается зашумленность.

Формат СЗМ данных, способы обработки и представления результатов эксперимента. Информация, полученная с помощью сканирующего зондового микроскопа, хранится в виде СЗМ кадра – двумерного массива целых чисел Z ij (матрицы). Каждому значению пары индексов ij соответствует определенная точка поверхности в пределах поля сканирования. Координаты точек поверхности вычисляются с помощью простого умножения соответствующего индекса на величину расстояния между точками, в которых производилось считывание информации. Как правило, СЗМ кадры представляют собой квадратные матрицы, имеющие размер 200x200 или 300х300 элементов.

Визуализация СЗМ кадров производится средствами компьютерной графики, в основном, в виде двумерных яркостных (2D) и трехмерных (3D) изображений. При 2D визуализации каждой точке поверхности Z=f(x,y) ставится в соответствие тон определенного цвета в соответствии с высотой точки поверхности (Рис. 1-7 а). При 3D визуализации изображение поверхности Z=f(x,y) строится в аксонометрической перспективе с помощью пикселей или линий. Наиболее эффективным способом раскраски 3D изображений является моделирование условий подсветки поверхности точечным источником, расположенным в некоторой точке пространства над поверхностью (Рис. 1-7 б). При этом удается подчеркнуть отдельные малые особенности рельефа.

СЗМ изображения, наряду с полезной информацией, содержат также много побочной информации, искажающей данные о морфологии и свойствах поверхности. СЗМ изображения, как правило, содержат постоянную составляющую, которая не несет полезной информации о рельефе поверхности, а отражает точность подвода образца в середину динамического диапазона перемещений сканера по оси Z. Постоянная составляющая удаляется из СЗМ кадра программным способом.

Рис. 1-7. Способы графического представления СЗМ-изображений:

а) – 2D, б) – 3D с боковой подсветкой

Изображения поверхности, получаемые с помощью зондовых микроскопов, как

правило, имеют общий наклон. Это может быть обусловлено несколькими причинами. Во-первых, наклон может появляться вследствие неточной установки образца относительно зонда или неплоскопараллельности образца; во-вторых, он может быть связан с температурным дрейфом, который приводит к смещению зонда относительно образца; в-третьих, он может быть обусловлен нелинейностью перемещений пьезосканера. На отображение наклона тратится большой объем полезного пространства в СЗМ кадре, так что становятся не видны мелкие детали изображения. Для устранения данного недостатка производят операцию вычитания постоянного наклона (левелинга) (Рис. 1-8).

Рис. 1-8. Устранение постоянного наклона из СЗМ-изображения

Неидеальность свойств пьезосканера приводит к тому, что СЗМ изображение

содержит ряд специфических искажений. В частности, поскольку движение сканера в плоскости образца влияет на положение зонда над поверхностью (по оси Z), СЗМ изображения представляют собой суперпозицию реального рельефа и некоторой поверхности второго (а часто и более высокого) порядка. Для устранения искажений такого рода методом наименьших квадратов находится аппроксимирующая поверхность второго порядка, имеющая минимальные отклонения от исходной поверхности, и затем данная поверхность вычитается из исходного СЗМ изображения.

Шумы аппаратуры, нестабильности контакта зонд-образец при сканировании, внешние акустические шумы и вибрации приводят к тому, что СЗМ изображения, наряду с полезной информацией, имеют шумовую составляющую. Частично шумы СЗМ изображений могут быть удалены программными средствами с помощью применения различных фильтров.

Конструкция СЗМ NanoEducator. На Рис. 1-9 представлен внешний вид измерительной головки СЗМ NanoEducator и обозначены основные элементы прибора, используемые при работе. На Рис. 1-10 представлена конструкция измерительной головки. На основании 1 расположены сканер 7 с держателем образца 6 и механизм подвода 2 на основе шагового двигателя. Подвод зонда 5, закрепленного на датчике взаимодействия 4, к образцу можно также осуществлять с помощью винта ручного подвода 3. Предварительный выбор места исследования на образце осуществляется с помощью винта 8.

Рис. 1-9. Внешний вид измерительной головки NanoEducator: 1 – основание, 2 – держатель образца, 3 – датчик взаимодействия, 4 – винт фиксации датчика, 5 – винт ручного подвода, 6 – винты перемещения сканера с образцом, 7 – крышка с видеокамерой

Рис. 1-10. Конструкция СЗМ NanoEducator: 1 – основание, 2 – механизм подвода, 3 – винт ручного подвода, 4 – датчик взаимодействия, 5 – винт фиксации датчика, 6 – зонд, 7 – держатель образца, 8 – сканер, 9, 10 – винты перемещения сканера с образцом

На Рис. 1-11 представлена функциональная схема прибора. NanoEducator состоит из измерительной головки, электронного блока, соединительных кабелей и управляющего компьютера. Видеокамера изображена как отдельное устройство, соединенное с компьютером. Сигнал от датчика взаимодействия после преобразования в предусилителе поступает в СЗМ контроллер. Управляющие сигналы от электронного блока поступают в измерительную головку. Управление электронным блоком осуществляется от компьютера через контроллер связи с PC.

Рис. 1-11. Функциональная схема прибора. NanoEducator

Универсальный датчик туннельного тока и силового взаимодействия. В приборе NanoEducator применяется универсальный датчик туннельного тока и модуляционного силового взаимодействия. Датчик выполнен в виде пьезокерамической трубки длиной l = 7 мм, диаметром d = 1.2 мм и толщиной стенки h = 0.25 мм, жестко закрепленной с одного конца. На внутреннюю поверхность трубки нанесен проводящий электрод. На внешнюю поверхность трубки нанесены два электрически изолированных полуцилиндрических электрода. К свободному концу трубки прикреплена вольфрамовая проволока диаметром 100 мкм (Рис. 1-12). Свободный конец проволоки, использующейся в качестве зонда, заточен электрохимически, радиус закругления имеет величину 0.2-0.05 мкм. Зонд имеет электрический контакт с внутренним электродом трубки, соединенным с заземленным корпусом прибора. При измерении туннельного тока пьезотрубка играет роль жесткой пассивной консоли. Электрическое смещение прикладывается к образцу относительно заземленного зонда (Рис. 1-13). Преобразователь, изображенный на рисунке, вырабатывает электрическое напряжение Uт, обуславливающее протекание туннельного тока I и выдает напряжение U пропорциональное этому току в электронный блок.

Рис. 1-12. Конструкция универсального Рис. 1-13. Принцип регистрации туннельного датчика прибора NanoEducator тока

В качестве датчика силового взаимодействия одна часть пьезоэлектрической трубки используется как пьезовибратор, а другая – как датчик механических колебаний. К пьезовибратору подводится переменное электрическое напряжение с частотой, равной резонансной частоте силового датчика. Амплитуда колебаний при большом расстоянии зонд образец максимальна. Как видно из Рис. 1-14, в процессе колебаний зонд отклоняется от равновесного положения на величину Ао, равную амплитуде его вынужденных механических колебаний (она составляет доли микрона), при этом на второй части пьезоэлемента (датчике колебаний) возникает переменное электрическое напряжение, пропорциональное смещению зонда, которая и измеряется прибором.

При приближении зонда к поверхности образца зонд начинает касаться образца в процессе колебаний. Это приводит к смещению амплитудно-частотной характеристики (АЧХ) колебаний датчика влево по сравнению с АЧХ, измеренной вдали от поверхности (Рис. 1-14). Так как частота вынуждающих колебаний пьезотрубки поддерживается постоянной и равной ω 0 в свободном состоянии, то при приближении зонда к поверхности амплитуда его колебаний уменьшается и становится равной A. Эта амплитуда колебаний регистрируется со второй половины пьезотрубки.

Рис. 1-14. Изменение частоты колебаний силового датчика при

приближении к поверхности образца

Сканер. Способ организации микроперемещений, использующийся в приборе NanoEducator, основан на использовании зажатой по периметру металлической мембраны, к поверхности которой приклеена пьезопластинка (Рис. 1-15 а). Изменение размеров пьезопластинки под действием управляющего напряжения будет приводить к изгибу мембраны. Расположив такие мембраны по трем перпендикулярным сторонам куба и соединив их центры металлическими направляющими, можно получить 3х-координатный сканер (Рис. 1-15 б).

Каждый пьезоэлемент 1, закрепленный на гранях куба 2, может передвигать прикрепленный к нему толкатель 3 в одном из трех взаимно перпендикулярных направлений – X, Y или Z при приложении к нему электрического напряжения. Как видно из рисунка, все три толкателя соединены в одной точке 4. С некоторым приближением можно считать, что эта точка перемещается по трем координатам X, Y, Z. К этой же точке прикрепляется стойка 5 с держателем образца 6. Таким образом, образец перемещается по трем координатам под действием трех независимых источников напряжения. В приборах NanoEducator максимальное перемещение образца составляет около 50-70 мкм, что и определяет максимальную площадь сканирования.

Рис. 1-15. Принцип действия (а) и конструкция (б) сканера прибора NanoEducator

Механизм автоматизированного подвода зонда к образцу (захват обратной связи) . Диапазон перемещений сканера по оси Z составляет около 10 мкм, поэтому перед началом сканирования необходимо приблизить зонд к образцу на это расстояние. Для этого предназначен механизм подвода, схема которого приведена на Рис. 1-16. Шаговый двигатель 1 при подаче на него электрических импульсов вращает винт подачи 2 и перемещает планку 3 с зондом 4, приближая или отдаляя его от образца 5, установленного на сканере 6. Величина одного шага составляет около 2 мкм.

Рис. 1-16. Схема механизма подвода зонда к поверхности образца

Так как шаг механизма подвода значительно превосходит величину требуемого расстояния зонд-образец в процессе сканирования, то во избежание деформации зонда его подвод осуществляется при одновременной работе шагового двигателя и перемещениям сканера по оси Z по следующему алгоритму:

Система обратной связи отключается и сканер “втягивается”, т. е. опускает образец в нижнее крайнее положение:

1. Механизм подвода зонда производит один шаг и останавливается.

2. Система обратной связи включается, и сканер плавно поднимает образец, одновременно производится анализ наличия взаимодействия зонд-образец.

3. Если взаимодействие отсутствует, процесс повторяется с пункта 1.

Если во время вытягивания сканера вверх появится ненулевой сигнал, система

обратной связи остановит движение сканера вверх и зафиксирует величину взаимодействия на заданном уровне. Величина силового взаимодействия, при котором произойдет остановка подвода зонда, и будет происходить процесс сканирования, в приборе NanoEducator характеризуется параметром Амплитуда останова (подавление амплитуды).

ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

1.Подготовка к измерениям.

После вызова программы NanoEducator на экране появляется главное окно. На Рис. 1-17 представлен фрагмент главного окна.

Рис. 1-17. Главное окно программы NanoEducator

Подготовку к измерениям рекомендуется проводить, используя окно Подготовка к сканированию . Окно открывается кнопкой на панели основных операций. Если контроллер прибора был включен до запуска программы NanoEducator, то при запуске программы произойдет автоматический выбор контроллера. В противном случае название контроллера следует выбрать в списке Выбор контроллера . Для работы прибора в качестве атомно-силового микроскопа, в меню Выбор режима выберите конфигурацию АСМ .

Похожая информация.

Введение

В настоящее время бурно развивается научно-техническое направление - нанотехнология, охватывающее широкий круг, как фундаментальных, так и прикладных исследований. Это принципиально новая технология, способная решать проблемы в таких разных областях, как связь, биотехнология, микроэлектроника и энергетика. Сегодня больше сотни молодых компаний разрабатывают нанотехнологические продукты, которые выйдут на рынок в ближайшие два - три года.

Нанотехнологии станут ведущими, в 21-м веке, технологиями и будут способствовать развитию экономики и социальной сферы общества, они могут стать предпосылкой новой промышленной революции. В предыдущие двести лет прогресс в промышленной революции был достигнут ценой затрат около 80% ресурсов Земли. Нанотехнологии позволят значительно уменьшить объем потребления ресурсов и не окажут давления на окружающую среду, они будут играть ведущую роль в жизни человечества, как, например, компьютер стал неотъемлемой частью жизни людей .

Прогресс в нанотехнологии стимулировался развитием экспериментальных методов исследований, наиболее информативными из которых являются методы сканирующей зондовой микроскопии, изобретением и в особенности распространением которых мир обязан нобелевским лауреатам 1986 года – профессору Генриху Рореру и доктору Герду Биннигу .

Мир был заворожен открытием столь простых методов визуализации атомов, да еще с возможностью манипуляции ими. Многие исследовательские группы принялись конструировать самодельные приборы и экспериментировать в данном направлении. В результате был рожден ряд удобных схем приборов, были предложены различные методы визуализации результатов взаимодействия зонд-поверхность, такие как: микроскопия латеральных сил, магнитно-силовая микроскопия, микроскопия регистрации магнитных, электростатических, электромагнитных взаимодействий. Получили интенсивное развитие методы ближнепольной оптической микроскопии. Были разработаны методы направленного, контролируемого воздействия в системе зонд-поверхность, например, нанолитография – изменения происходят на поверхности под действием электрических, магнитных воздействий, пластических деформаций, света в системе зонд-поверхность. Были созданы технологии производства зондов с заданными геометрическими параметрами, со специальными покрытиями и структурами для визуализации различных свойств поверхностей .

Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) – один из мощных современных методов исследования морфологии и локальных свойств поверхности твердого тела с высоким пространственным разрешением. За последние 10 лет сканирующая зондовая микроскопия превратилась из экзотической методики, доступной лишь ограниченному числу исследовательских групп, в широко распространенный и успешно применяемый инструмент для исследования свойств поверхности. В настоящее время практически ни одно исследование в области физики поверхности и тонкопленочных технологий не обходится без применения методов СЗМ. Развитие сканирующей зондовой микроскопии послужило также основой для развития новых методов в нанотехнологии – технологии создания структур с нанометровыми масштабами .

1. Историческая справка

Для наблюдения мелких объектов голландец Антони ван Левенгук в 17 веке изобрел микроскоп, открыв мир микробов. Его микроскопы был несовершенными и давали увеличение от 150 до 300 раз. Но е го последователи усовершенствовали этот оптический прибор, заложив фундамент для многих открытий в биологии, геологии, физике. Однако в конце 19 века (1872 г.) немецкий оптик Эрнст Карл Аббе показал, что из-за дифракции света разрешающая способность микроскопа (то есть минимальное расстояние между объектами, когда они еще не сливаются в одно изображение) ограничена длиной световой волны (0.4 – 0.8 мкм). Тем самым он сэкономил массу усилий оптиков, пытавшихся сделать более совершенные микроскопы, но разочаровал биологов и геологов, лишившихся надежды получить прибор с увеличением выше 1500x.

История создания электронного микроскопа – замечательный пример того, как самостоятельно развивающиеся области науки и техники могут, обмениваясь полученной информацией и объединяя усилия, создавать новый мощный инструмент научных исследований. Вершиной классической физики была теория электромагнитного поля, которая объяснила распространение света, возникновение электрических и магнитных полей, движение заряженных частиц в этих полях как распространение электромагнитных волн. Волновая оптика сделала понятными явление дифракции, механизм формирования изображения и игру факторов, определяющих разрешение, в световом микроскопе. Успехам в области теоретической и экспериментальной физики мы обязаны открытием электрона с его специфическими свойствами. Эти отдельные и, казалось бы, независимые пути развития привели к созданию основ электронной оптики, одним из важнейших приложений которой являлось изобретение ЭМ в 1930-х годах. Прямым намеком на такую возможность можно считать гипотезу о волновой природы электрона, выдвинутую в 1924 Луи де Бройлем и экспериментально подтвержденную в 1927 К.Дэвиссоном и Л.Джермером в США и Дж.Томсоном в Англии. Тем самым была подсказана аналогия, позволившая построить ЭМ по законам волновой оптики. Х.Буш обнаружил, что с помощью электрических и магнитных полей можно формировать электронные изображения. В первые два десятилетия 20 в. были созданы и необходимые технические предпосылки. Промышленные лаборатории, работавшие над электронно-лучевым осциллографом, дали вакуумную технику, стабильные источники высокого напряжения и тока, хорошие электронные эмиттеры .

В 1931 Р.Руденберг подал патентную заявку на просвечивающий электронный микроскоп, а в 1932 М.Кнолль и Э.Руска построили первый такой микроскоп, применив магнитные линзы для фокусировки электронов. Этот прибор был предшественником современного оптического просвечивающего электронного микроскопа (ОПЭМ). (Руска был вознагражден за свои труды тем, что стал лауреатом Нобелевской премии по физике за 1986.) В 1938 Руска и Б. фон Боррис построили прототип промышленного ОПЭМ для фирмы «Сименс-Хальске» в Германии; этот прибор в конце концов позволил достичь разрешения 100 нм. Несколькими годами позднее А.Пребус и Дж.Хиллер построили первый ОПЭМ высокого разрешения в Торонтском университете (Канада).

Широкие возможности ОПЭМ почти сразу же стали очевидны. Его промышленное производство было начато одновременно фирмой «Сименс-Хальске» в Германии и корпорацией RCA в США. В конце 1940-х годов такие приборы стали выпускать и другие компании .

РЭМ в его нынешней форме был изобретен в 1952 Чарльзом Отли. Правда, предварительные варианты такого устройства были построены Кноллем в Германии в 1930-х годах и Зворыкиным с сотрудниками в корпорации RCA в 1940-х годах, но лишь прибор Отли смог послужить основой для ряда технических усовершенствований, завершившихся внедрением в производство промышленного варианта РЭМ в середине 1960-х годов. Круг потребителей такого довольно простого в обращении прибора с объемным изображением и электронным выходным сигналом расширился с быстротой взрыва. В настоящее время насчитывается добрый десяток промышленных изготовителей РЭМ"ов на трех континентах и десятки тысяч таких приборов, используемых в лабораториях всего мира. В 1960-х годах разрабатывались сверхвысоковольтные микроскопы для исследования более толстых образцов. Лидером этого направления разработок был Г.Дюпуи во Франции, где в 1970 был введен в действие прибор с ускоряющим напряжением, равным 3,5 млн. вольт. РТМ был изобретен Г.Биннигом и Г.Рорером в 1979 в Цюрихе. Этот весьма простой по устройству прибор обеспечивает атомное разрешение поверхностей. За свою работу по созданию РТМ Бинниг и Рорер (одновременно с Руской) получили Нобелевскую премию.

В 1986 году Рорером и Биннигом был изобретен сканирующий зондовый микроскоп. С момента своего изобретения СТМ широко используется учеными самых разных специальностей, охватывающих практически все естественнонаучные дисциплины начиная от фундаментальных исследований в области физики, химии, биологии и до конкретных технологических приложений. Принцип действия СТМ настолько прост, а потенциальные возможности так велики, что невозможно предсказать его воздействие на науку и технику даже ближайшего будущего.

Как оказалось в дальнейшем, практически любые взаимодействия острийного зонда с поверхностью (механические, магнитные) могут быть преобразованы с помощью соответствующих приборов и компьютерных программ в изображение поверхности .

Установка сканирующего зондового микроскопа состоит из нескольких функциональных блоков, изображенных на рис. 1. Это, во-первых, сам микроскоп с пьезоманипулятором для управления зондом, преобразователем туннельного тока в напряжение и шаговым двигателем для подвода образца; блок аналого-цифровых и цифро-аналоговых преобразователей и высоковольтных усилителей; блок управления шаговым двигателем; плата с сигнальным процессором, рассчитывающим сигнал обратной связи; компьютер, собирающий информацию и обеспечивающий интерфейс с пользователем. Конструктивно блок ЦАПов и АЦП установлен в одном корпусе с блоком управления шаговым двигателем. Плата с сигнальным процессором (DSP – Digital Signal Processor) ADSP 2171 фирмы Analog Devices установлена в ISA слот расширения персонального компьютера .

Общий вид механической системы микроскопа представлен на рис. 2. В механическую систему входит основание с пьезоманипулятором и системой плавной подачи образца на шаговом двигателе с редуктором и две съемные измерительные головки для работы в режимах сканирующей туннельной и атомно-силовой микроскопии. Микроскоп позволяет получить устойчивое атомное разрешение на традиционных тестовых поверхностях без применения дополнительных сейсмических и акустических фильтров .

2. Принципы работы сканирующих зондовых микроскопов

В сканирующих зондовых микроскопах исследование микрорельефа поверхности и ее локальных свойств проводится с помощью специальным образом приготовленных зондов в виде игл. Рабочая часть таких зондов (острие) имеет размеры порядка десяти нанометров. Характерное расстояние между зондом и поверхностью образцов в зондовых микроскопах по порядку величин составляет 0,1 – 10 нм. В основе работы зондовых микроскопов лежат различные типы взаимодействия зонда с поверхностью. Так, работа туннельного микроскопа основана на явлении протекания туннельного тока между металлической иглой и проводящим образцом; различные типы силового взаимодействия лежат в основе работы атомно-силового, магнитно-силового и электросилового микроскопов. Рассмотрим общие черты, присущие различным зондовым микроскопам. Пусть взаимодействие зонда с поверхностью характеризуется некоторым параметром Р. Если существует достаточно резкая и взаимно однозначная зависимость параметра Р от расстояния зонд-образец, то данный параметр может быть использован для организации системы обратной связи (ОС), контролирующей расстояние между зондом и образцом. На рис. 3 схематично показан общий принцип организации обратной связи СЗМ .

Система обратной связи поддерживает значение параметра Р постоянным, равным величине , задаваемой оператором. Если расстояние зонд-поверхность изменяется, то происходит изменение параметра Р. В системе ОС формируется разностный сигнал, пропорциональный величине ΔР = Р - Р, который усиливается до нужной величины и подается на исполнительный элемент ИЭ. Исполнительный элемент отрабатывает данный разностный сигнал, приближая зонд к поверхности или отодвигая его до тех пор, пока разностный сигнал не станет равным нулю. таким образом можно поддерживать расстояние зонд – образец с большой точностью. При перемещении зонда вдоль поверхности образца происходит изменение параметра взаимодействия Р, обусловленное рельефом поверхности. Система ОС отрабатывает эти изменения, так что при перемещении зонда в плоскости Х, Y сигнал на исполнительном элементе оказывается пропорциональным рельефу поверхности. Для получения СЗМ изображения осуществляют специальным образом организованный процесс сканирования образца. При сканировании зонд вначале движется над образцом вдоль определенной линии (строчная развертка), при этом величина сигнала на исполнительном элементе, пропорциональная рельефу поверхности, записывается в память компьютера. Затем зонд возвращается в исходную точку и переходит на следующую строку сканирования (кадровая развертка), и процесс повторяется вновь. Записанный таким образом при сканировании сигнал обратной связи обрабатывается компьютером, а затем СЗМ изображение рельефа поверхности строится с помощью средств компьютерной графики. Наряду с исследованием рельефа поверхности, зондовые микроскопы позволяют изучать различные свойства поверхности: механические, электрические, магнитные, оптические и другие .

3. Сканирующие элементы (сканеры) зондовых микроскопов

3.1 Сканирующие элементы

Для работы зондовых микроскопов необходимо контролировать рабочее расстояние зонд-образец и осуществлять перемещения зонда в плоскости образца с высокой точностью (на уровне долей ангстрема). Эта задача решается с помощью специальных манипуляторов – сканирующих элементов (сканеров). Сканирующие элементы зондовых микроскопов изготавливаются из пьезоэлектриков – материалов, обладающих пьезоэлектрическими свойствами. Пьезоэлектрики изменяют свои размеры во внешнем электрическом поле. Уравнение обратного пьезоэффекта для кристаллов записывается в виде:

где u – тензор деформации, E– компоненты электрического поля, d – компоненты тензора пьезоэлектрических коэффициентов. Вид тензора пьезоэлектрических коэффициентов определяется типом симметрии кристаллов .

В различных технических приложениях широкое распространение получили преобразователи из пьезокерамических материалов. Пьезокерамика представляет собой поляризованный поликристаллический материал, получаемый методами спекания порошков из кристаллических сегнетоэлектриков. Поляризация керамики производится следующим образом. Керамику нагревают выше температуры Кюри (для большинства пьезокерамик эта температура менее 300С), а затем медленно охлаждают в сильном (порядка 3 кВ/см) электрическом поле. После остывания пьезокерамика имеет наведенную поляризацию и приобретает способность изменять свои размеры (увеличивать или уменьшать в зависимости от взаимного направления вектора поляризации и вектора внешнего электрического поля).

В сканирующей зондовой микроскопии широкое распространение получили трубчатые пьезоэлементы (рис. 4). Они позволяют получать достаточно большие перемещения объектов при относительно небольших управляющих напряжениях. Трубчатые пьезоэлементы представляют собой полые тонкостенные цилиндры, изготовленные из пьезокерамических материалов. Обычно электроды в виде тонких слоев металла наносятся на внешнюю и внутреннюю поверхности трубки, а торцы трубки остаются непокрытыми.

Под действием разности потенциалов между внутренним и внешним электродами трубка изменяет свои продольные размеры. В этом случае продольная деформация под действием радиального электрического поля может быть записана в виде:

где l – длина трубки в недеформируемом состоянии. Абсолютное удлинение пьезотрубки равно

где h – толщина стенки пьезотрубки, V – разность потенциалов между внутренним и внешним электродами. Таким образом, при одном и том же напряжении V удлинение трубки будет тем больше, чем больше ее длина и чем меньше толщина ее стенки .

Соединение трех трубок в один узел позволяет организовать прецизионные перемещения зонда микроскопа в трех взаимно перпендикулярных направлениях. Такой сканирующий элемент называется триподом.

Недостатками такого сканера являются сложность изготовления и сильная асимметрия конструкции. На сегодняшний день в сканирующей зондовой микроскопии наиболее широко используются сканеры, изготовленные на основе одного трубчатого элемента. Общий вид трубчатого сканера и схема расположения электродов представлены на рис. 5. Материал трубки имеет радиальное направление вектора поляризации.

Внутренний электрод обычно сплошной. Внешний электрод сканера разделен по образующим цилиндра на четыре секции. При подаче противофазных напряжений на противоположные секции внешнего электрода (относительно внутреннего) происходит сокращение участка трубки в том месте, где направление поля совпадает с направлением поляризации, и удлинение там, где они направлены в противоположные стороны. Это приводит к изгибу трубки в соответствующем направлении. Таким образом осуществляется сканирование в плоскости Х, Y. Изменение потенциала внутреннего электрода относительно всех внешних секций приводит к удлинению или сокращению трубки по оси Z. Таким образом, можно организовать трехкоординатный сканер на базе одной пьезотрубки. Реальные сканирующие элементы имеют часто более сложную конструкцию, однако принципы их работы остаются теми же самыми .

Широкое распространение получили также сканеры на основе биморфных пьезоэлементов. Биморф представляет собой две пластины пьезоэлектрика, склеенные между собой таким образом, что вектора поляризации в каждой из них направлены в противоположные стороны (рис. 6). Если подать напряжение на электроды биморфа, как показано на рис. 6, то одна из пластин будет расширяться, а другая сжиматься, что приведет к изгибу всего элемента. В реальных конструкциях биморфных элементов создается разность потенциалов между внутренним общим и внешними электродами так, чтобы в одном элементе поле совпадало с направлением вектора поляризации, а в другом было направлено противоположно.

Изгиб биморфа под действием электрических полей положен в основу работы биморфных пьезосканеров. Объединяя три биморфных элемента в одной конструкции, можно реализовать трипод на биморфных элементах.

Если внешние электроды биморфного элемента разделить на четыре сектора, то можно организовать движение зонда по оси Z и в плоскости X, Y на одном биморфном элементе (рис. 7).

Действительно, подавая противофазные напряжения на противоположные пары секций внешних электродов, можно изгибать биморф так, сто зонд будет двигаться в плоскости X, Y (рис. 7 (а, б)). А изменяя потенциал внутреннего электрода относительно всех секций внешних электродов, можно прогибать биморф, перемещая зонд в направлении Z (рис. 7 (в, г)) .

3.2 Нелинейность пьезокерамики

Несмотря на ряд технологических преимуществ перед кристаллами, пьезокерамики обладают некоторыми недостатками, отрицательно влияющими на работу сканирующих элементов. Одним из таких недостатков является нелинейность пьезоэлектрических свойств. На рис. 8 в качестве примера приведена зависимость величины смещения пьезотрубки в направлении Z от величины приложенного поля. В общем случае (особенно при больших управляющих полях) пьезокерамики характеризуются нелинейной зависимостью деформаций от поля (или от управляющего напряжения).

Таким образом, деформация пьезокерамики является сложной функцией внешнего электрического поля:

Для малых управляющих полей данная зависимость может быть представлена в следующем виде:

u = d* E+ α* E*Е+…

где d и α - линейные и квадратичные модули пьезоэлектрического эффекта.

Типичные значения полей Е, при которых начинают сказываться нелинейные эффекты, составляют порядка 100 В/мм. Поэтому для корректной работы сканирующих элементов обычно используются управляющие поля в области линейности керамики (Е < Е) .

электронный микроскоп сканирующий зондовый

3.3 Крип пьезокерамики и гистерезис пьезокерамики

Другим недостатком пьезокерамики является так называемый крип (creep – ползучесть) – запаздывание реакции на изменение величины управляющего электрического поля.

Крип приводит к тому, что в СЗМ изображениях наблюдаются геометрические искажения, связанные с этим эффектом. Особенно сильно крип сказывается при выводе сканеров в заданную точку для проведения локальных измерений и на начальных этапах процесса сканирования. Для уменьшения влияния крипа керамики применяются временные задержки в указанных процессах, позволяющие частично скомпенсировать запаздывание сканера.

Еще одним недостатком пьезокерамик является неоднозначность зависимости удлинения от направления изменения электрического поля (гистерезис).

Это приводит к тому, что при одних и тех же управляющих напряжениях пьезокерамика оказывается в различных точках траектории в зависимости от направления движения. Для исключений искажений СЗМ изображений, обусловленных гистерезисом пьезокерамики, регистрацию информации при сканировании образцов производят только на одной из ветвей зависимости .

4. Устройства для прецизионных перемещений зонда и образца

4.1 Механические редукторы

Одной из важных технических проблем в сканирующей зондовой микроскопии является необходимость прецизионного перемещения зонда и образца с целью образования рабочего промежутка микроскопа и выбора исследуемого участка поверхности. Для решения этой проблемы применяются различные типы устройств, осуществляющих перемещение объектов с высокой точностью. Широкое распространение получили различные механические редукторы, в которых грубому перемещению исходного движителя соответствует тонкое перемещение смещаемого объекта. Способы редукции перемещений могут быть различными. Широко применяются рычажные устройства, в которых редукция величины перемещения осуществляется за счет разницы длины плеч рычагов. Схема рычажного редуктора приведена на рис. 9.

Механический рычаг позволяет получать редукцию перемещения с коэффициентом

Таким образом, чем больше отношение плеча L к плечу l, тем более точно можно контролировать процесс сближения зонда и образца.

Также в конструкциях микроскопов широко используются механические редукторы, в которых редукция перемещений достигается за счет разницы коэффициентов жесткости двух последовательно соединенных упругих элементов (рис. 10). Конструкция состоит из жесткого основания, пружины и упругой балки. Жесткости пружины k и упругой балки К подбирают таким образом, чтобы выполнялось условие: k < K .

Коэффициент редукции равен отношению коэффициентов жесткости упругих элементов:

Таким образом, чем больше отношение жесткости балки к жесткости пружины, тем точнее можно контролировать смещение рабочего элемента микроскопа.

4.2 Шаговые электродвигатели

Шаговые электродвигатели (ШЭД) представляют собой электромеханические устройства, которые преобразуют электрические импульсы в дискретные механические перемещения. Важным преимуществом шаговых электродвигателей является то, что они обеспечивают однозначную зависимость положения ротора от входных импульсов тока, так что угол поворота ротора определяется числом управляющих импульсов. В ШЭД вращающий момент создается магнитными потоками, создаваемыми полюсами статора и ротора, которые соответствующим образом ориентированы друг относительно друга.

Наиболее простую конструкцию имеют двигатели с постоянными магнитами. Они состоят из статора, который имеет обмотки, и ротора, содержащего постоянные магниты. На рис. 11 представлена упрощенная конструкция шагового электродвигателя.

Чередующиеся полюса ротора имеют прямолинейную форму и расположены параллельно оси двигателя. Показанный на рисунке двигатель имеет 3 пары полюсов ротора и 2 пары полюсов статора. Двигатель имеет 2 независимые обмотки, каждая из которых намотана на два противоположные полюса статора. показанный двигатель имеет величину шага 30 град. При включении тока в одной из обмоток ротор стремится занять такое положение, при котором разноименные полюса ротора и статора находятся друг напротив друга. Для осуществления непрерывного вращения нужно включать обмотки попеременно.

На практике применяются шаговые электродвигатели, имеющие более сложную конструкцию и обеспечивающие от 100 до 400 шагов на один оборот ротора. Если такой двигатель работает в паре с резьбовым соединением, то при шаге резьбы порядка 0,1 мм обеспечивается точность позиционирования объекта порядка 0,25 – 1 мкм. Для увеличения точности применяются дополнительные механические редукторы. Возможность электрического управления позволяет эффективно использовать ШЭД в автоматизированных системах сближения зонда и образца сканирующих зондовых микроскопов .

4.3 Шаговые пьезодвигатели

Требования хорошей изоляции приборов от внешних вибраций и необходимость работы зондовых микроскопов в условиях вакуума накладывают серьезные ограничения на применение чисто механических устройств для перемещений зонда и образца. В связи с этим широкое распространение в зондовых микроскопах получили устройства на основе пьезоэлектрических преобразователей, позволяющих осуществлять дистанционное управление перемещением объектов.

Одна из конструкций шагового инерционного пьезодвигателя приведена на рис. 12. Данное устройство содержит основание (1), на котором закреплена пьезоэлектрическая трубка (2). Трубка имеет электроды (3) на внешней и внутренней поверхностях. На конце трубки укреплена разрезная пружина (4), представляющая собой цилиндр с отдельными пружинящими лепестками. В пружине установлен держатель объекта (5) – достаточно массивный цилиндр с полированной поверхностью. Перемещаемый объект может крепиться к держателю с помощью пружины или накидной гайки, что позволяет устройству работать при любой ориентации в пространстве.

Устройство работает следующим образом. Для перемещения держателя объекта в направлении оси Z к электродам пьезотрубки прикладывается импульсное напряжение пилообразной формы (рис. 13).

На пологом фронте пилообразного напряжения трубка плавно удлиняется или сжимается в зависимости от полярности напряжения, и ее конец вместе с пружиной и держателем объекта смещается на расстояние:

В момент сброса пилообразного напряжения трубка возвращается в исходное положение с ускорением a, имеющим вначале максимальную величину:

где ω – резонансная частота продольных колебаний трубки. При выполнении условия F < ma (m – масса держателя объекта, F - сила трения между держателем объекта и разрезной пружиной), держатель объекта, в силу своей инерционности, проскальзывает относительно разрезной пружины. В результате держатель объекта перемещается на некоторый шаг К Δl относительно исходного положения. Коэффициент К определяется соотношением масс деталей конструкции и жесткостью разрезной пружины. При смене полярности импульсов управляющего напряжения происходит изменение направления движения объекта. Таким образом, подавая пилообразные напряжения различной полярности на электроды пьезотрубки, можно перемещать объект в пространстве и производить сближение зонда и образца в сканирующем зондовом микроскопе .

5. Защита зондовых микроскопов от внешних воздействий

5.1 Защита от вибраций

Для защиты приборов от внешних вибраций применяются различные типы виброизолирующих систем. Условно их можно разделить на пассивные и активные. Основная идея, заложенная в пассивные виброизолирующие системы, заключается в следующем. Амплитуда вынужденных колебаний механической системы быстро спадает при увеличении разницы между частотой возбуждающей силы и собственной резонансной частотой системы (типичная амплитудно-частотная характеристика (АЧХ) колебательной системы приведена на рис. 14).

Поэтому внешние воздействия с частотами ω > ω практически не оказывает заметного влияния на колебательную систему. Следовательно, если поместить измерительную головку зондового микроскопа на виброизолирующую платформу или на упругий подвес (рис. 15), то на корпус микроскопа пройдут лишь внешние колебания с частотами, близкими к резонансной частоте виброизолирующей системы. Поскольку собственные частоты головок СЗМ составляют 10 – 100 кГц, то, выбирая резонансную частоту виброизолирующей системы достаточно низкой (порядка 5 – 10 Гц), можно весьма эффективно защитить прибор от внешних вибраций. С целью гашения колебаний на собственных резонансных частотах в виброизолирующие системы вводят диссипативные элементы с вязким трением.

Таким образом, для обеспечения эффективной защиты необходимо, чтобы резонансная частота виброизолирующей системы была как можно меньше. Однако на практике реализовать очень низкие частоты трудно.

Для защиты головок СЗМ успешно применяются активные системы подавления внешних вибраций. Такие устройства представляют собой электромеханические системы с отрицательной обратной связью, которая обеспечивает стабильное положение виброизолирующей платформы в пространстве (рис. 16) .

5.2 Защита от акустических шумов

Еще одним источником вибрации элементов конструкции зондовых микроскопов являются акустические шумы различной природы.

Особенностью акустических помех является то, что акустические волны непосредственно воздействуют на элементы конструкции головок СЗМ, что приводит к колебаниям зонда относительно поверхности исследуемого образца. Для защиты СЗМ от акустических помех применяются различные защитные колпаки, позволяющие существенно снизить уровень акустической помехи в области рабочего промежутка микроскопа. Наиболее эффективной защитой от акустических помех является размещение измерительной головки зондового микроскопа в вакуумной камере (рис. 17) .

5.3 Стабилизация термодрейфа положения зонда над поверхностью

Одной из важных проблем СЗМ является задача стабилизации положения зонда над поверхностью исследуемого образца. Главным источником нестабильности положения зонда является изменение температуры окружающей среды или разогрев элементов конструкции зондового микроскопа во время его работы. Изменение температуры твердого тела приводит к возникновению термоупругих деформаций. Такие деформации весьма существенно влияют на работу зондовых микроскопов. Для уменьшения термодрейфа применяют термостатирование измерительных головок СЗМ или вводят в конструкцию головок термокомпенсирующие элементы. Идея термокомпенсации заключается в следующем. Любую конструкцию СЗМ можно представить в виде набора элементов с различными коэффициентами теплового расширения (рис. 18 (а)).

Для компенсации термодрейфа в конструкцию измерительных головок СЗМ вводят компенсирующие элементы, имеющие различные коэффициенты расширения, так, чтобы выполнялось условие равенства нулю суммы температурных расширений в различных плечах конструкции:

ΔL = ∑ ΔL = ΔT ∑αl0

Наиболее простым способом уменьшения термодрейфа положения зонда по оси Z является введение в конструкцию СЗМ компенсирующих элементов из того же материала и с теми же характерными размерами, что и основные элементы конструкции (рис. 18 (б)). При изменении температуры такой конструкции смещение зонда в направлении Z будет минимальным. Для стабилизации положения зонда в плоскости X, Y измерительные головки микроскопов изготавливаются в виде аксиально-симметричных конструкций .

6. Формирование и обработка СЗМ изображений

6.1 Процесс сканирования

Процесс сканирования поверхности в сканирующем зондовом микроскопе имеет сходство с движением электронного луча по экрану в электроннолучевой трубке телевизора. Зонд движется вдоль линии (строки) сначала в прямом, а потом в обратном направлении (строчная развертка), а затем переходит на следующую строку (кадровая развертка) (рис. 19). Движение зонда осуществляется с помощью сканера небольшими шагами под действием пилообразных напряжений, формируемых цифро-аналоговыми преобразователями. Регистрация информации о рельефе поверхности производится, как правило, на прямом проходе.

Информация, полученная с помощью сканирующего зондового микроскопа, хранится в виде СЗМ кадра – двумерного массива целых чисел a (матрицы). Физический смысл данных чисел определяется той величиной, которая оцифровывалась в процессе сканирования. Каждому значению пары индексов ij соответствует определенная точка поверхности в пределах поля сканирования. Координаты точек поверхности вычисляются с помощью простого умножения соответствующего индекса на величину расстояния между точками, в которых производилась запись информации.

Как правило, СЗМ кадры представляют собой квадратные матрицы, имеющие размер 2 (в основном 256х256 и 512х512 элементов). Визуализация СЗМ кадров производится средствами компьютерной графики, в основном, в виде трехмерных (3D) и двумерных яркостных (2D) изображений. При 3D визуализации изображение поверхности строится в аксонометрической перспективе с помощью пикселей или линий. В дополнение к этому используются различные способы подсвечивания пикселей, соответствующих различной высоте рельефа поверхности. Наиболее эффективным способом раскраски 3D изображений является моделирование условий подсветки поверхности точечным источником, расположенным в некоторой точке пространства над поверхностью (рис. 20). При этом удается подчеркнуть мелкомасштабные неровности рельефа. Также средствами компьютерной обработки и графики реализуются масштабирование и вращение 3D СЗМ изображений. При 2D визуализации каждой точки поверхности ставится в соответствие цвет. Наиболее широко используются градиентные палитры, в которых раскраска изображения производится тоном определенного цвета в соответствии с высотой точки поверхности.

Локальные СЗМ измерения, как правило, сопряжены с регистрацией зависимостей исследуемых величин от различных параметров. Например, это зависимости величины электрического тока через контакт зонд-поверхность от приложенного напряжения, зависимости различных параметров силового взаимодействия зонда и поверхности от расстояния зонд-образец и др. Данная информация хранится в виде векторных массивов или в виде матриц 2 х N. Для их визуализации в программном обеспечении микроскопов предусматривается набор стандартных средств изображения графиков функций.

6.2 Методы построения и обработки изображений

При изучении свойств объектов методами сканирующей зондовой микроскопии основным результатом научного поиска являются, как правило, трехмерные изображения поверхности этих объектов. Адекватность интерпретации изображений зависит от квалификации специалиста. Вместе с тем, при обработке и построении изображений используется ряд традиционных приемов, о которых следует знать при анализе изображений. Сканирующий зондовый микроскоп появился в момент интенсивного развития компьютерной техники. Поэтому при записи трехмерных изображений в нем были использованы цифровые методы хранения информации, разработанные для компьютеров. Это привело к значительному удобству при анализе и обработке изображений, однако пришлось пожертвовать фотографическим качеством, присущим методам электронной микроскопии. Информация, полученная с помощью зондового микроскопа, в компьютере представляется в виде двумерной матрицы целых чисел. Каждое число в этой матрице, в зависимости от режима сканирования, может являться значением туннельного тока, или значением отклонения или значением какой-то более сложной функции. Если показать человеку эту матрицу, то никакого связного представления об исследуемой поверхности он получить не сможет. Итак, первая проблема - это преобразовать числа в вид, удобный для восприятия. Делается это следующим образом. Числа в исходной матрице лежат в некотором диапазоне, есть минимальное и максимальное значения. Этому диапазону целых чисел ставится в соответствие цветовая палитра. Таким образом, каждое значение матрицы отображается в точку определенного цвета на прямоугольном изображении. Строка и столбец, в которых находится это значение, становятся координатами точки. В результате мы получаем картину, на которой, например, высота поверхности передается цветом – как на географической карте. Но на карте обычно используются лишь десятки цветов, а на нашей картине их сотни и тысячи. Для удобства восприятия точки, близкие по высоте, должны передаваться сходными цветами. Может оказаться, и, как правило, так всегда и бывает, что диапазон исходных значений больше, чем число возможных цветов. В этом случае происходит потеря информации, и увеличение количества цветов не является выходом из положения, так как возможности человеческого глаза ограничены. Требуется дополнительная обработка информации, причем в зависимости от задач обработка должна быть разной. Кому-то необходимо увидеть всю картину целиком, а кто-то хочет рассмотреть детали. Для этого используются разнообразные методы .

6.3 Вычитание постоянного наклона

Изображения поверхности, получаемые с помощью зондовых микроскопов, как правило, имеют общий наклон. Это может быть обусловлено несколькими причинами. Во-первых, наклон может появляться вследствие неточной установки образца относительно зонда; во-вторых, он может быть связан с температурным дрейфом, который приводит к смещению зонда относительно образца; в-третьих, он может быть обусловлен нелинейностью перемещений пьезосканера. На отображение наклона тратится большой объем полезного пространства в СЗМ кадре, так что становятся не видны мелкие детали изображения. Для устранения данного недостатка производят операцию вычитания постоянного наклона. Для этого на первом этапе методом наименьших квадратов находится аппроксимирующая плоскость

Р(х,y), имеющая минимальные отклонения от рельефа поверхности Z = f(x,y) затем производится вычитание данной плоскости из СЗМ изображения. Вычитание целесообразно выполнять различными способами в зависимости от природы наклона.

Если наклон в СЗМ изображении обусловлен наклоном образца относительно образца зонда, то целесообразно произвести поворот плоскости на угол, соответствующий углу между нормалью к плоскости и осью Z; при этом координаты поверхности Z = f(x,y) преобразуются в соответствии с преобразованиями пространственного поворота. Однако при данном преобразовании возможно получение изображения поверхности в виде многозначной функции Z = f(x,y). Если наклон обусловлен термодрейфом, то процедура вычитания наклона сводится к вычитанию Z – координат плоскости из Z – координат СЗМ изображения:

В результате получается массив с меньшим диапазоном значений, и мелкие детали изображения будут отражаться большим количеством цветов, становясь более заметными .

6.4 Устранение искажений, связанных с неидеальностью сканера

Неидеальность свойств сканера приводит к тому, что СЗМ изображение содержит ряд специфических искажений. Частично неидеальности сканера, такие как неравноправность прямого и обратного хода сканера (гистерезис), крип и нелинейность пьезокерамики компенсируются аппаратными средствами и выбором оптимальных режимов сканирования. Однако, несмотря на это, СЗМ изображения содержат искажения, которые трудно устранить на аппаратном уровне. В частности, поскольку движение сканера в плоскости образца влияет на положение зонда над поверхностью, СЗМ изображения представляют собой суперпозицию реального рельефа и некоторой поверхности второго (а часто и более высокого) порядка.

Для устранения искажения такого рода методом наименьших квадратов находится аппроксимирующая поверхность второго порядка Р(x,y), имеющая минимальные отклонения от исходной функции Z = f(x,y), и затем данная поверхность вычитается из исходного СЗМ изображения:

Еще один тип искажений связан с нелинейностью и неортогональностью перемещений сканера в плоскости X, Y. Это приводит к искажению геометрических пропорций в различных частях СЗМ изображения поверхности. Для устранения таких искажений производят процедуру коррекции СЗМ изображений с помощью файла коэффициентов коррекции, который создается при сканировании конкретным сканером тестовых структур с хорошо известным рельефом .

6.5 Фильтрация СЗМ изображений

Шумы аппаратуры (в основном, это шумы высокочувствительных входных усилителей), нестабильности контакта зонд-образец при сканировании, внешние акустические шумы и вибрации приводят к тому, что СЗМ изображения, наряду с полезной информацией, имеют шумовую составляющую. Частично шумы СЗМ изображений могут быть удалены программными средствами .

6.6 Медианная фильтрация

Хорошие результаты при удалении высокочастотных случайных помех в СЗМ кадрах дает медианная фильтрация. Это нелинейный метод обработки изображений, суть которого можно пояснить следующим образом. Выбирается рабочее окно фильтра, состоящее из nxn точек (для определенности возьмем окно 3 х 3, т.е. содержащее 9 точек (рис. 24)).

В процессе фильтрации это окно перемещается по кадру от точки к точке, и производится следующая процедура. Значения амплитуды СЗМ изображения в точках данного окна выстраиваются по возрастанию, и значение, стоящее в центре отсортированного ряда, заносится в центральную точку окна. Затем окно сдвигается в следующую точку, и процедура сортировки повторяется. Таким образом, мощные случайные выбросы и провалы при такой сортировке всегда оказываются на краю сортируемого массива и не войдут в итоговое (отфильтрованное) изображение. При такой обработке по краям кадра остаются нефильтрованные области, которые отбрасываются в конечном изображении .

6.7 Методы восстановления поверхности по ее СЗМ изображению

Одним из недостатков, присущих всем методам сканирующей зондовой микроскопии, является конечный размер рабочей части используемых зондов. Это приводит к существенному ухудшению пространственного разрешения микроскопов и значительным искажениям в СЗМ изображениях при сканировании поверхностей с неровностями рельефа, сравнимыми с характерными размерами рабочей части зонда.

Фактически получаемое в СЗМ изображение является «сверткой» зонда и исследуемой поверхности. Процесс «свертки» формы зонда с рельефом поверхности проиллюстрирован в одномерном случае на рис. 25.

Частично данную проблему позволяют решить развитые в последнее время методы восстановления СЗМ изображений, основанные на компьютерной обработке СЗМ данных с учетом конкретной формы зондов. Наиболее эффективным методом восстановления поверхности является метод численной деконволюции, использующий форму зонда, получаемую экспериментально при сканировании тестовых (с хорошо известным рельефом поверхности) структур .

Следует отметить, что полное восстановление поверхности образца возможно лишь при соблюдении двух условий: зонд в процессе сканирования коснулся всех точек поверхности, и в каждый момент зонд касался только одной точки поверхности. Если же зонд в процессе сканирования не может достигнуть некоторых участков поверхности (например, если образец имеет нависающие участки рельефа), то происходит лишь частичное восстановление рельефа. Причем, чем большего числа точек поверхности касался зонд при сканировании, тем достовернее можно реконструировать поверхность.

На практике СЗМ изображение и экспериментально определенная форма зонда представляет собой двумерные массивы дискретных значений, для которых производная является плохо определенной величиной. Поэтому вместо вычисления производной дискретных функций на практике при численной деконволюции СЗМ изображений используется условие минимальности расстояния между зондом и поверхностью при сканировании с постоянной средней высотой .

В этом случае за высоту рельефа поверхности в данной точке можно принять минимальное расстояние между точкой зонда и соответствующей точкой поверхности для данного положения зонда относительно поверхности. По своему физическому смыслу данное условие эквивалентно условию равенства производных, однако оно позволяет проводить поиск точек касания зонда с поверхностью более адекватным методом, что существенно сокращает время реконструирования рельефа.

Для калибровки и определения формы рабочей части зондов используются специальные тестовые структуры с известными параметрами рельефа поверхности. Виды наиболее распространенных тестовых структур и их характерные изображения, полученные с помощью атомно-силового микроскопа представлены на рис. 26 и рис. 27 .

Калибровочная решетка в виде острых шипов позволяет хорошо прописывать кончик зонда, в то время как прямоугольная решетка помогает восстановить форму боковой поверхности. Комбинируя результаты сканирования данных решеток, можно полностью восстанавливать форму рабочей части зондов .

7. Современные СЗМ

1) Сканирующий зондовый микроскоп SM-300

Предназначен для изучение морфологических особенностей и структуры порового пространства. SM-300 (рис. 28) снабжен встроенным микроскопом оптического позиционирования, который избавляет от необходимости бесконечного поиска области, представляющей интерес. Цветное оптическое изображение выборки, с небольшим увеличением, отображается на компьютерном мониторе. Перекрестие на оптическом изображении соответствует позиции электронного луча. Используя перекрестие, можно произвести быстрое позиционирование, чтобы задать область, представляющую интерес для анализа растровым

Рис. 28. СЗМ SM-300 электронным микроскопом. Блок оптического позиционирования оснащен отдельным компьютером, что обеспечивает его аппаратную независимость от сканирующего микроскопа.

ВОЗМОЖНОСТИ SM - 300

· Гарантируемая разрешающая способность 4 нм

· Уникальный оптический позиционирующий микроскоп (дополнительно)

· Интуитивно понятное программное обеспечение Windows ®

· Полностью компьютерное управление растровым микроскопом и построением изображений

· Стандартный телевизионный вывод с обработкой цифрового сигнала

· Компьютерное управление системой низкого вакуума (опция)

· Все исследования, выполняются на одном положении оси аппликат (12 мм)

· Элементный рентгеновский микроанализ в режимах низкого и высокого вакуума (дополнительно)

· Возможность работы в условиях нормального комнатного освещения

· Исследование непроводящих образцов без их предварительной подготовки

· Разрешающая способность 5.5 нм в режиме низкого вакуума

· Программное управление переключением режимов

· Выбираемый диапазон вакуума камеры 1.3 – 260 Пa

· Вывод изображения на экран компьютерного монитора

· Последовательный V-обратно рассеянный датчик Робинсона

2) Сканирующий зондовый микроскоп высокого разрешения Supra50VP с системой микроанализа INCA Energy+Oxford.

Прибор (рис. 29) предназначен для проведения исследований во всех областях материаловедения, в области нано- и биотехнологий. Прибор позволяет работать с образцами большого размера, кроме того он поддерживает режим работы в условиях переменного давления для исследования непроводящих образцов без подготовки. Рис. 29. СЗМ Supra50VP

ПАРАМЕТРЫ:

Ускоряющее напряжение 100 В – 30 кВ (катод с полевой эмиссией)

Макс. увеличение до х 900000

Сверхвысокое разрешение – до 1 нм (при 20 кВ)

Вакуумный режим с переменным давлением от 2 до 133 Па

Ускоряющее напряжение – от 0.1 до 30 кВ

Моторизированный столик с пятью степенями свободы

Разрешение EDX детектора 129 эВ на линии Ka(Mn), скорость счета до 100000 имп/с

3) LEO SUPRA 25 модернизированный микроскоп с «GEMINI» колонной и с полевой эмиссией (рис.30).

– Разработан для исследований в области наноанализа

– Можно подключать как EDX, так и WDX системы для микроанализа

– Разрешение 1.5 нм на 20 кВ, 2 нм на 1 кВ.

Заключение

За прошедшие годы применения зондовой микроскопии позволило достичь уникальных научных результатов в различных областях физики, химии и биологии.

Если первые сканирующие зондовые микроскопы были приборами-индикаторами для качественных исследований, то современный сканирующий зондовый микроскоп – это прибор, интегрирующий в себе до 50 различных методик исследования. Он способен осуществлять заданные перемещения в системе зонд-образец с точностью до 0,1%, рассчитывать форм-фактор зонда, производить прецизионные измерения достаточно больших размеров (до 200 мкм в плоскости сканирования и 15 – 20 мкм по высоте) и, при этом, обеспечивать субмолекулярное разрешение.

Сканирующие зондовые микроскопы превратились в один из наиболее востребованных на мировом рынке классов приборов для научных исследований. Постоянно создаются новые конструкции приборов, специализированные для различных приложений.

Динамичное развитие нанотехнологии требует все большего и большего расширения возможностей исследовательской техники. Высокотехнологичные компании во всем мире работают над созданием исследовательских и технологических нанокомплексов, объединяющих в себе целые группы аналитических методов, таких как: спектроскопия комбинационного рассеяния света, люминесцентная спектроскопия, рентгеновская спектроскопия для элементного анализа, методы оптической микроскопии высокого разрешения, электронной микроскопии, техники фокусированных ионных пучков. Системы приобретают мощные интеллектуальные возможности: способность распознавать и классифицировать изображения, выделять требуемые контрасты, наделяются возможностями по моделированию результатов, а вычислительные мощности обеспечиваются использованием суперкомпьютеров.

Разрабатываемая техника имеет могучие возможности, но конечной целью ее использования является получение научных результатов. Овладение возможностями этой техники само по себе является задачей высокой степени сложности, требующей подготовки высококлассных специалистов, способных эффективно пользоваться этими приборами и системами.

Список литературы

1. Неволин В. К. Основы туннельно-зондовой технологии / В. К. Неволин, – М.: Наука, 1996, – 91 с.

2. Кулаков Ю. А. Электронная микроскопия / Ю. А. Кулаков, – М.: Знание, 1981, – 64 с.

3. Володин А.П. Сканирующая микроскопия / А. П. Володин, – М.: Наука, 1998, – 114 с.

4. Сканирующая зондовая микроскопия биополимеров / Под редакцией И. В. Яминского, – М.: Научный мир, 1997, – 86 с.

5. Миронов В. Основы сканирующей зондовой микроскопии / В. Миронов, – М.: Техносфера, 2004, – 143 с.

6. Рыков С. А. Сканирующая зондовая микроскопия полупроводниковых материалов / С. А. Рыков, – СПБ: Наука, 2001, – 53 с.

7. Быков В. А., Лазарев М. И. Сканирующая зондовая микроскопия для науки и промышленности / В. А. Быков, М. И. Лазарев // Электроника: наука, технология, бизнес, – 1997, – №5, – с. 7 – 14.

СКАНИРУЮЩИЕ ЗОНДОВЫЕ МИКРОСКОПЫ: ВИДЫ И ПРИНЦИП РАБОТЫ

Кувайцев Александр Вячеславович
Димитровградский инженерно-технологический институт филиал национального исследовательского ядерного университета «МИФИ»
студент

Аннотация
В данной статье описывается принцип работы зондового микроскопа. Это принципиально новая технология, способная решать проблемы в таких разных областях, как связь, биотехнология, микроэлектроника и энергетика. Нанотехнологии в микроскопии позволят значительно уменьшить объем потребления ресурсов и не окажут давления на окружающую среду, они будут играть ведущую роль в жизни человечества, как, например, компьютер стал неотъемлемой частью жизни людей.

SCANNING PROBE MICROSCOPY: TYPES AND OPERATING PRINCIPLES

Kuvaytsev Aleksandr Vyacheslavovich
Dimitrovgrad Engineering and Technological Institute of the National Research Nuclear University MEPHI
student

Abstract
This article describes the principle of a probe microscope. It is a new technology that can solve problems in such diverse areas as communications, biotechnology, microelectronics and energy. Nanotechnology in microscopy will significantly reduce the consumption of resources and do not put pressure on the environment, they will play a leading role in human life, as, for example, the computer has become an integral part of people"s lives.

В 21-м веке стремительно набирают популярность нанотехнологии, которые проникают во все сферы нашей жизни, но прогресса в них не было бы без новых, экспериментальных методов исследований, одним из наиболее информативных является метод сканирующей зондовой микроскопии, которую изобрели и распространили нобелевские лауреаты 1986 года – профессор Генрих Рорер и доктор Герд Бинниг.

В мире произошла настоящая революция с появлением методов визуализации атомов. Стали появляться группы энтузиастов, конструировавшие свои приборы. В итоге получилось несколько удачных решений для визуализации результатов взаимодействия зонда с поверхностью. Были созданы технологии производства зондов с необходимыми параметрами.

Так что же представляет из себя зондовый микроскоп? В первую очередь это непосредственно зонд, который исследует поверхность образца, так же необходима система перемещения зонда относительно образца в двумерном или трехмерном представлении (перемещается по X-Y или X-Y-Z координатам). Все это дополняет регистрирующая система, которая фиксирует значение функции, зависящей от расстояния от зонда до образца. Регистрирующая система фиксирует и запоминает значение по одной из координат.

Основные типы сканирующих зондовых микроскопов можно разделить на 3 группы:

1. Сканирующий туннельный микроскоп – предназначен для измерения рельефа проводящих поверхностей с высоким пространственным разрешением.
   В СТМ острая металлическая игла проводится над образцом на очень малом расстоянии. При подаче на иглу небольшого тока между ней и образцом возникает туннельный ток, величину которого фиксирует регистрирующая система. Игла проводится над всей поверхностью образца и фиксирует малейшие изменение тоннельного тока, благодаря чему вырисовывается карта рельефа поверхности образца. СТМ первый из класса сканирующих зондовых микроскопов, остальные были разработаны позднее.
2. Сканирующий атомно-силовой микроскоп – используется для построения структуры поверхности образца с разрешением до атомарного. В отличии от СТМ с помощью этого микроскопа можно исследовать как проводящие так и непроводящие поверхности. Из-за способности не только сканировать но и манипулировать атомами, назван силовым.
3. Ближнепольный оптический микроскоп – «усовершенствованный» оптический микроскоп, обеспечивающий разрешение лучше чем у обычного оптического. Повышение разрешения БОМа было достигнуто путем улавливания света от изучаемого объекта на расстояниях меньших, чем длинна волны. В случае если зонд микроскопа снабжен устройством для сканирования пространственного поля, то такой микроскоп называют сканирующим оптическим микроскопом ближнего поля. Такой микроскоп позволяет получить изображения поверхностей и с очень высоким разрешением.

На изображении (рис. 1) показана простейшая схема работы зондового микроскопа.

Рисунок 1. - Схема работы зондового микроскопа

Его работа основана на взаимодействии поверхности образца с зондом, это может быть кантилевер, игла или оптический зонд. При малом расстоянии между зондом и объектом исследования действия сил взаимодействия, такие как отталкивания притяжение и т.д., и проявление эффектов, таких как, туннелирование электронов, можно зафиксировать с помощью средств регистрации. Для детектирования этих сил используются очень чувствительные сенсоры способные уловить малейшие изменения. Пьезотрубки или плоскопараллельные сканеры используются как система развертки по координатам для получения растрового изображения..

К основным техническим сложностям при создании сканирующих зондовых микроскопов можно отнести:

1. Обеспечение механической целостности
2. Детекторы должны иметь максимальную чувствительность
3. Конец зонда должен иметь минимальные размеры
4. Создание системы развертки
5. Обеспечения плавности зонда

Почти всегда полученное сканирующим зондовым микроскопом изображение плохо поддается расшифровке из-за искажений при получении результатов. Как правило необходима дополнительная математическая обработка. Для этого используется специализированное ПО.

В настоящее время, сканирующая зондовая и электронная микроскопия используются как дополняющие друг друга методы исследования из-за ряда физических и технических особенностей. За прошедшие годы применение зондовой микроскопии позволило получить уникальные научные исследования в областях физики, химии и биологии. Первые микроскопы были всего лишь приборами – индикаторами, помогающими в исследованиях, а современные образцы это полноценные рабочие станции, включающие в себя до 50 различных методик исследования.

Главной задачей этой передовой техники является получение научных результатов, но применение возможностей этих приборов на практике требует высокой квалификации от специалиста.

Класс микроскопов для получения изображения поверхности и её локальных характеристик. Процесс построения изображения основан на сканировании поверхности зондом. В общем случае позволяет получить 3-х мерное изображение поверхности (топографию) с высоким разрешением.

Сканирующий зондовый микроскоп в современном виде был изобретён Гердом Карлом Биннигом и Генрихом Рорером в 1981 году. За это изобретение в 1986 были награждены Нобелевской премией по физике.

Отличительной особенностью всех микроскопов является микроскопический зонд, который контактирует с исследуемой поверхностью, и при сканировании перемещается по некоторому участку поверхности заданного размера.

Контакт зонда и образца подразумевает взаимодействие. Природа взаимодействия определяет принадлежность прибора к типу зондовых микроскопов. Информация о поверхности извлекается с помощью системы обратной связи или детектирования взаимодействия зонда и образца.

Система регистрирует значение функции, зависящей от расстояния зонд - образца.

Типы сканирующих зондовых микроскопов.

Сканирующий атомно-силовой микроскоп

Сканирующий туннельный микроскоп

Ближнепольный оптический микроскоп

Сканирующий туннельный микроскоп

Один из вариантов сканирующего микроскопа, предназначенный для изменения рельефа проводящих систем с высоким пространственным разрешением.

Принцип работы основан на прохождение электроном потенциального барьера в результате разрыва электрической цепи – небольшой промежуток между зондирующим микроскопом и поверхностью образца. Острая металлическая игла подводится к образцу на расстояние нескольких ангстрем. При подаче на иглу небольшого потенциала возникает туннельный ток, величина которого экспоненциально зависит от расстояния образец - игла. При расстоянии 1ангстремма образец – игла значение силы тока колеблется от 1 до 100 пА.

При сканировании образца игла движется вдоль её поверхности, туннельный ток поддерживается за счёт действия обратной связи. Показания системы меняется за счёт топографии поверхности. Изменение поверхности фиксируется и на этом основании строится карта высот.

Другой метод предполагает движение иглы на фиксированной высоте над поверхностью образца. В этом случае изменяется величина туннельного тока и на основе этих изменений идёт построение топографии поверхности.

Рисунок 1. Схема работы сканирующего туннельного микроскопа.

Сканирующий туннельный микроскоп включает в себя:

Зонд (игла)

Систему перемещения зона по координатам

Регистрирующую систему

Регистрирующая система фиксирует значение функции, зависящая от величины тока между иглой и образцом, либо перемещения по оси Z. Регистрируемое значение обрабатывается системой обратной связи, управляя положением образца или зонда по оси координат. В качестве обратной связи используется пид - регулятор (пропорционально – интегрально – дифференцирующей регулятор).

Ограничение:

Условие проводимости образца (поверхностное сопротивление должно быть не больше 20 МОм/см²).

Глубина канавки должна быть меньше её ширины, иначе будет наблюдаться туннелирование с боковых поверхностей.